德國(guó)牧羊犬復(fù)孔絳蟲(chóng)種類(lèi)鑒定和遺傳進(jìn)化分析

簡(jiǎn)永利，于三科，宋軍科，王會(huì)寶，高永安，王清艷，李培德，涂宜強(qiáng)

(1.溫州科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325006；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046)

犬復(fù)孔絳蟲(chóng)(Dipylidiumcaninum)是一種寄生在犬、貓、狐等動(dòng)物小腸中的常見(jiàn)寄生蟲(chóng)，需要節(jié)肢動(dòng)物毛虱或蚤作為中間宿主完成其生活史。據(jù)國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道，犬和貓的感染率為6.25%～40.8%[1,2]。輕度感染時(shí)，犬、貓一般無(wú)臨床癥狀，幼犬感染可引起消化不良、腹痛、腹瀉、肛門(mén)瘙癢等臨床癥狀，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)死亡[3]。人偶爾因誤食含有似囊尾蚴的蚤而感染，據(jù)報(bào)道至少23個(gè)國(guó)家或地區(qū)有散在發(fā)生的病例[4]。犬復(fù)孔絳蟲(chóng)病呈世界性分布，雖然人感染的風(fēng)險(xiǎn)較低，但嬰幼兒和1歲～5歲的兒童感染的病例較多，主要與其玩娛習(xí)慣和感染的犬、貓接觸密切有關(guān)[4-5]。我國(guó)北京、四川、河北、福建、山東、安徽、山西、河南、湖南等地有病例報(bào)告。目前為止，成年人感染比較少見(jiàn)，國(guó)內(nèi)僅報(bào)道有3例，而兒童特別是5歲以?xún)?nèi)的兒童感染較多，最小患兒僅33日齡，感染嚴(yán)重的兒童可見(jiàn)食欲不振、消化不良、腹痛、肛門(mén)瘙癢、消化障礙等臨床癥狀[6-8]。因此，正確鑒定復(fù)孔絳蟲(chóng)的種類(lèi)，對(duì)預(yù)防和控制犬復(fù)孔絳蟲(chóng)病及人畜共患風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。

目前，對(duì)犬復(fù)孔絳蟲(chóng)的鑒定主要基于形態(tài)學(xué)方法，主要通過(guò)檢查糞便中是否含有米粒樣的孕卵節(jié)片或包含數(shù)個(gè)蟲(chóng)卵的卵囊袋[9]。但復(fù)孔絳蟲(chóng)形態(tài)相似，臨床中僅依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法也難以對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。因此，迫切需要一種更為有效、可靠的方法用于犬復(fù)孔絳蟲(chóng)病的臨床診斷。

研究表明，分子標(biāo)記技術(shù)可有效地對(duì)絳蟲(chóng)、吸蟲(chóng)、線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行分類(lèi)鑒定[10-12]。線(xiàn)粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)作為細(xì)胞核外的獨(dú)立遺傳物質(zhì)，已廣泛作為寄生蟲(chóng)分類(lèi)鑒定、群體遺傳和系統(tǒng)進(jìn)化研究的理想分子標(biāo)記。目前用于絳蟲(chóng)分類(lèi)鑒定的基因包括細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ亞基(cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，cox1)基因、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶Ⅰ亞基(nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase Ⅰ subunit，nad1)基因、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer region，ITS)等[13-15]。本研究以溫州某品種犬飼養(yǎng)場(chǎng)死亡的3只犬體內(nèi)分離的絳蟲(chóng)為研究對(duì)象，通過(guò)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法并結(jié)合線(xiàn)粒體cox1和nad1基因的遺傳進(jìn)化分析進(jìn)行研究，以期為復(fù)孔絳蟲(chóng)病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查和防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲(chóng)體 本試驗(yàn)蟲(chóng)體3條(分別名為WZ1、WZ2、WZ3)，采自溫州某品種犬場(chǎng)急性死亡的3只德國(guó)牧羊犬。剖檢發(fā)現(xiàn)小腸中有大量絳蟲(chóng)并阻塞腸道，小心取下蟲(chóng)體以確保蟲(chóng)體完整性，處理干凈后置于750 mL/L乙醇中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 乙醇、樹(shù)膠、DNA提取試劑，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶體系、瓊脂糖、DNA Marker DL 2 000，寶生生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；10 g/L孔雀綠染液，上海銘博生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠電泳試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 本試驗(yàn)所用引物參照Bowles等(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成[17]。

表1 犬復(fù)孔絳蟲(chóng)cox1和 nad1基因部分序列擴(kuò)增引物Table 1 Primers for amplication of partial cox1 and nad1 gene sequences of D.caninum

1.1.4 儀器設(shè)備 PCR擴(kuò)增儀，博日科技有限公司產(chǎn)品；DYY-7C穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；水平電泳槽，SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；HH-3A數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；Motic成像顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；離心機(jī)、移液器，Eppendorf公司產(chǎn)品；自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蟲(chóng)體形態(tài)學(xué)鑒定 將復(fù)孔絳蟲(chóng)完整蟲(chóng)體從750 mL/L乙醇中取出，用滅菌蒸餾水清洗3次，依次從頭節(jié)向后分別剪成2 cm左右的小段，置于乳酸透明液透明3 h；蟲(chóng)體的染色根據(jù)文獻(xiàn)[9,16]寄生蟲(chóng)玻片制備方法，用孔雀綠染液對(duì)采集的絳蟲(chóng)進(jìn)行標(biāo)本制作。最后將風(fēng)干1周的標(biāo)本片置于顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。此外，采集的新鮮蟲(chóng)體取下孕卵節(jié)片并刺戳多個(gè)針孔，在生理鹽水中洗滌節(jié)片，將洗滌的生理鹽水3 000 r/min離心后，取收集的蟲(chóng)卵于10×40倍鏡下觀(guān)察，并結(jié)合蟲(chóng)體形態(tài)，做初步鑒定。

1.2.2 蟲(chóng)體基因組DNA的提取 將保存的3條絳蟲(chóng)蟲(chóng)體用生理鹽水洗滌3次，剪取1 cm左右的蟲(chóng)體片段放置于1.5 mL離心管中，加入蛋白酶K，將其置于56℃水浴鍋中消化過(guò)夜，次日按DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取的DNA樣品置-20℃冰箱，備用。

1.2.3cox1基因和nad1基因的PCR擴(kuò)增、電泳和測(cè)序 PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括蒸餾水11 μL、1×TaqMix液12.5 μL、引物各0.5 μL和模板DNA 1 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；再72℃延伸5 min。取5 μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)攝像并記錄結(jié)果。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物直接送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 序列分析 用ClustalX1.83軟件對(duì)3條蟲(chóng)體樣品的cox1和nad1序列進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)從GenBank中檢索現(xiàn)有復(fù)孔絳蟲(chóng)cox1和nad1序列(登錄號(hào)為AB732959和MG587892)進(jìn)行相似性比對(duì)和分析。以日本血吸蟲(chóng)(Schistosomajaponicum)為外群，將本研究中3個(gè)復(fù)孔絳蟲(chóng)cox1和nad1序列與GenBank上收錄的其他絳蟲(chóng)線(xiàn)粒體基因序列，用Mega軟件中的Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)(Boot-Strap值為1000)。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

新鮮蟲(chóng)體為乳白色或淡紅色，頭節(jié)小，固定后為白色，約由200個(gè)節(jié)片組成，長(zhǎng)約為15 cm～20 cm，寬約3 mm，寄生于德牧犬腸道內(nèi)。染色后蟲(chóng)體內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)(圖1)。每一成熟節(jié)片內(nèi)含兩組生殖器官，睪丸100個(gè)～200個(gè)，生殖孔開(kāi)口于蟲(chóng)體兩側(cè)中央靠后的位置，形似瓜籽，故稱(chēng)為瓜籽絳蟲(chóng)。卵巢葡萄狀，位于生殖孔附近；孕卵節(jié)片分化為大量的儲(chǔ)卵囊，每個(gè)儲(chǔ)卵囊內(nèi)大約含有約10個(gè)以上的蟲(chóng)卵。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

3條絳蟲(chóng)樣品中均成功擴(kuò)增出約450 bp和500 bp的基因片段，與預(yù)期的目的片段大小相符，且未出現(xiàn)非特異性條帶，空白對(duì)照為陰性(圖2)。陽(yáng)性樣品測(cè)序結(jié)果顯示，3條絳蟲(chóng)的pcox1和pnad1核苷酸序列分別為445 bp和535 bp。通過(guò)核苷酸序列比較，3個(gè)樣品測(cè)序結(jié)果完全一致。堿基分析表明，pcox1和pnad1基因A、T含量分別為69.44% 和69.72%，與D.caninum犬基因型(AB732959)序列比對(duì)，分別存在4個(gè)堿基突變，相似性為99.08%和99.05%，而與D.caninum貓基因型(MG587892)序列相比，分別有41個(gè)、73個(gè)堿基發(fā)生改變，同源性?xún)H為90.57%和85.80%。

2.3 pcox1和pnad1種系發(fā)育分析

應(yīng)用MEGA軟件，將PCR擴(kuò)增所得的目的序列與GenBank 上收錄的犬復(fù)孔絳蟲(chóng)(犬)(D.caninum(dog))、犬復(fù)孔絳蟲(chóng)(貓)(D.caninum(cat))、日本海闊裂頭絳蟲(chóng)(Diphyllobothriumnihonkaiense)、刺猬絳蟲(chóng)(Spirometraerinaceieuropaei)、縮小膜殼絳蟲(chóng)(Hymenolepisdiminuta)、大裸頭絳蟲(chóng)(Anoplocephalamagna)、豬帶絳蟲(chóng)(Taeniasolium)、大復(fù)殖孔絳蟲(chóng)(Diplogonoporusgrandis)的線(xiàn)粒體基因序列，并以日本血吸蟲(chóng)作為外群進(jìn)行種群遺傳進(jìn)化分析。

a.儲(chǔ)卵囊；b.卵巢；c.生殖孔；d.蟲(chóng)卵a(bǔ).Egg packets；b.Oariy；c.Genital pore；d.Egg圖1 成熟節(jié)片、孕卵節(jié)片(孔雀綠染色，40倍)和卵囊袋Fig.1 Mature proglottids,gravid proglottids(Malachite green staining,40×)and egg packets

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對(duì)照；2～4.德國(guó)牧羊犬3個(gè)復(fù)孔絳蟲(chóng)蟲(chóng)體樣品M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2-4.Three samples of D.caninum from German shepherd dogs圖2 犬復(fù)孔絳蟲(chóng)pcox1(左)和pnad1(右)基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果Fig.2 PCR-amplication results of the partial genes of pcox1(left)and pnad1(right)of D.caninum

基于pcox1和pnad1基因序列構(gòu)建的種群進(jìn)化發(fā)育樹(shù)表明，本研究中的3個(gè)蟲(chóng)體基因序列位于同一分支，與犬源D.caninum(AB732959)親緣關(guān)系最近，形成姐妹支，而與貓?jiān)碊.caninum(MG587892)親緣關(guān)系次之。最終，3個(gè)分離蟲(chóng)體與犬源D.caninum(AB732959)和貓?jiān)碊.caninum(MG587892)合成一大支。將其與其他種屬絳蟲(chóng)比較，犬復(fù)孔絳蟲(chóng)與A.magna、T.solium、H.diminuta等圓葉目絳蟲(chóng)分屬一支，與D.nihonkaiense、S.erinaceieuropaei、D.grandis等假葉目絳蟲(chóng)距離更遠(yuǎn)，得到很好的鑒別(圖3)。

圖3 基于pcox1和pnad1基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree reconstructed using the pcox1 and pnad1 gene sequences

3 討論

復(fù)孔絳蟲(chóng)為雙殼科復(fù)孔屬絳蟲(chóng)，有數(shù)十種，其中以犬復(fù)孔絳蟲(chóng)最為常見(jiàn)。犬復(fù)孔絳蟲(chóng)的診斷主要依靠蟲(chóng)體形態(tài)結(jié)構(gòu)(頭節(jié)、頂突、成節(jié)形狀和內(nèi)部生殖器官結(jié)構(gòu)、孕節(jié)卵袋等)、卵袋(形狀，包含蟲(chóng)卵數(shù)量)和蟲(chóng)卵(大小、形狀、結(jié)構(gòu))特征為主要鑒定依據(jù)。本試驗(yàn)采用10 g/L的孔雀綠對(duì)犬復(fù)孔絳蟲(chóng)進(jìn)行染色，蟲(chóng)體染色結(jié)構(gòu)與LIDIA、邢維媚描述的蟲(chóng)體形態(tài)基本一致[4,9]，生殖孔開(kāi)口于蟲(chóng)體兩側(cè)中央靠后的位置，卵巢呈葡萄狀，位于生殖孔附近；孕卵節(jié)片含有大量的儲(chǔ)卵囊，每個(gè)儲(chǔ)卵囊內(nèi)大約含有10個(gè)以上個(gè)蟲(chóng)卵。犬復(fù)孔絳蟲(chóng)卵殼薄，呈透明，內(nèi)含有六鉤蚴，與其它帶絳蟲(chóng)卵相近[7]，臨床上出現(xiàn)過(guò)誤診漏診報(bào)道，因此僅通過(guò)形態(tài)學(xué)特征很難對(duì)蟲(chóng)體間有差異的蟲(chóng)種種屬進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒定。

分子生物學(xué)技術(shù)可有效、精確地區(qū)分生物種群的遺傳進(jìn)化程度。在病原的分子分類(lèi)、遺傳變異和種群結(jié)構(gòu)研究中，線(xiàn)粒體DNA作為一種重要的、有效的分子標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于多種人獸共患寄生蟲(chóng)的種間、種內(nèi)鑒定和種系發(fā)育分析研究[5,18]。其中，cox1和nad1基因具有種特異性和種內(nèi)高保守性，因此常作為分子標(biāo)記應(yīng)用于絳蟲(chóng)的分類(lèi)鑒定。為了對(duì)采集的絳蟲(chóng)進(jìn)行種類(lèi)鑒定以及遺傳進(jìn)化分析，本研究的3個(gè)樣本中均成功擴(kuò)增出pcox1和pnad1的目的基因片段，且測(cè)序結(jié)果也完全一致，表明這2個(gè)基因片段都比較保守，提示本試驗(yàn)采集的3個(gè)蟲(chóng)體同屬一個(gè)種。進(jìn)一步對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，pcox1和pnad1與犬復(fù)孔絳蟲(chóng)犬基因型的同源性為99.08%和99.05%，而與犬復(fù)孔絳蟲(chóng)貓基因型相似性?xún)H為90.57%和85.80%，表明本試驗(yàn)3個(gè)蟲(chóng)體與犬復(fù)孔絳蟲(chóng)犬基因型相近，為同一個(gè)屬的絳蟲(chóng)。

基于線(xiàn)粒體基因序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化分析，犬復(fù)孔絳蟲(chóng)存在兩種基因型，犬復(fù)孔絳蟲(chóng)犬基因型和犬復(fù)孔絳蟲(chóng)貓基因型，并通過(guò)混合性感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其確實(shí)為2個(gè)不同的基因型，提示犬復(fù)孔絳蟲(chóng)有2個(gè)適應(yīng)不同宿主的基因型[19-20]。采用ML構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)，顯示本研究中的3個(gè)蟲(chóng)體與D.caninum犬基因型和D.caninum貓基因型都位于同一分支，與D.caninum犬基因型親緣關(guān)系最近，同源性最高，與D.caninum貓基因型有一些分離，在一定程度上，提示犬復(fù)孔絳蟲(chóng)是一個(gè)復(fù)合體，這一結(jié)論與國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者對(duì)犬復(fù)孔絳蟲(chóng)的線(xiàn)粒體基因序列分析一致[5,18-21]，進(jìn)一步支持犬復(fù)孔絳蟲(chóng)存在2個(gè)適應(yīng)不同宿主的蟲(chóng)株這一結(jié)論。3條蟲(chóng)體所屬分支與圓葉目絳蟲(chóng)構(gòu)成一大分支，而與假葉目絳蟲(chóng)所屬分支較遠(yuǎn),說(shuō)明cox1和nad1可作為理想的遺傳標(biāo)記用于絳蟲(chóng)分類(lèi)和進(jìn)化研究中，這也為犬復(fù)孔絳蟲(chóng)病的診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查和防控奠定基礎(chǔ)。