鱖源維氏氣單胞菌的分離鑒定及毒力基因分析

鄧汝森，張建州，張浩權(quán)，黎家明，羅世誠(chéng)，顏廣智，陳盛楠，黃良宗

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528000)

鱖(Sinipercachuatsi)，即鱖魚(yú)，俗稱翹嘴鱖、桂花魚(yú)、桂魚(yú)等，為硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、鱖亞科(Sinipercina)、鱖屬(Siniperca)，為我國(guó)特有的淡水肉食性兇猛魚(yú)類，其生長(zhǎng)過(guò)程對(duì)水質(zhì)的要求較高[1-2]。近年來(lái)，隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，鱖魚(yú)養(yǎng)殖密度逐漸加大，水質(zhì)條件也隨之變差；很多繁殖場(chǎng)不注重苗種選育，近親繁殖較為普遍，從而導(dǎo)致鱖魚(yú)抗逆性和抗病性越來(lái)越差[3]。2020年10月，廣東省肇慶市某養(yǎng)殖池塘鱖魚(yú)出現(xiàn)大規(guī)模游塘死亡，檢查發(fā)現(xiàn)魚(yú)脊部、腹部和尾鰭等部位帶有輕微白色潰瘍，肝臟、腎臟和腸道未見(jiàn)明顯病理變化。該池塘的鱖魚(yú)在3 d前已出現(xiàn)零星死亡，用阿莫西林、維生素C等藥物后效果不明顯；常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)顯示，氨氮含量高達(dá)1.2 mg/L，亞硝酸鹽0.2 mg/L，pH8.1，平均水溫21℃。采集病變明顯的鱖魚(yú)在低溫條件下送實(shí)驗(yàn)室，未檢測(cè)到相關(guān)病毒，鏡檢無(wú)寄生蟲(chóng)，對(duì)其進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源及試驗(yàn)用動(dòng)物 發(fā)病鱖魚(yú)體重28 g±2 g，采集于廣東省肇慶市某鱖魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)。動(dòng)物回歸試驗(yàn)用的健康鱖魚(yú)，廣東省肇慶市某鱖魚(yú)繁殖場(chǎng)，體重40 g±3 g，共120尾。

1.1.2 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和血平板，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌生化鑒定管，杭州微生物試劑有限公司；藥敏紙片，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA Marker DL 2 000、Gold view 染料、pMD18-T載體連接試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，TaKaRa 公司；細(xì)菌DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 T-cycles PCR儀，美國(guó)MJ ReSearch 公司；水平電泳槽、電泳儀，北京百晶生物技術(shù)有限公司；數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離純化及形態(tài)觀察 參照文獻(xiàn)[4]，無(wú)菌條件下，挑取患病鱖魚(yú)病變明顯的潰瘍組織，用無(wú)菌接種環(huán)接種于含100 mL/L小牛血清和10 g/L NAD的營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，28℃恒溫條件下分別進(jìn)行有氧和厭氧培養(yǎng)24 h，挑取典型的優(yōu)勢(shì)單菌落接種于血平板純化培養(yǎng)，蘸取純化培養(yǎng)的菌落固定于載玻片上，革蘭氏染色后鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)特征。把分離菌轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基進(jìn)一步鑒定。

1.2.2 細(xì)菌生化特性鑒定 無(wú)菌操作，挑取分離菌接種于微量生化鑒定管，28℃恒溫下培養(yǎng)24 h，進(jìn)行細(xì)菌鑒定[5]。

1.2.3 細(xì)菌16S rRNA及gyrB基因序列分析 按細(xì)菌DNA抽提試劑盒說(shuō)明抽提分離菌DNA，作為PCR反應(yīng)模板。用16S rRNA通用引物和gyrB基因特異性引物[6]進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后取產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，將陽(yáng)性產(chǎn)物做膠回收，連接PMD-18T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30 min，42℃熱擊90 s，冰浴3 min，加入LB肉湯37℃培養(yǎng)45 min后涂布氨芐平板，分別挑取5個(gè)陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的參考菌株序列進(jìn)行比對(duì)，用MEGA7.0 軟件中的Neighbour-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，重復(fù)抽樣1 000次對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)各分支進(jìn)行置信度分析。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.4 人工感染試驗(yàn) 選取健康、體重接近的鱖魚(yú)進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。無(wú)菌操作挑取分離菌接種于LB營(yíng)養(yǎng)肉湯，28℃、220 r/min振搖培養(yǎng)18 h。經(jīng)LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)后，菌液濃度分別調(diào)整為4.5×109、4.5×108、4.5×107、4.5×106CFU/mL。本試驗(yàn)設(shè)A、B、C、D 4組為攻毒組，E組為對(duì)照組，每組8尾鱖魚(yú)，攻毒組分別腹腔注射0.1 mL上述菌液；對(duì)照組注射等量生理鹽水，重復(fù)3次試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)組的鱖魚(yú)分別暫養(yǎng)于1 m×0.8 m×0.8 m的水族缸，每天換水20%，溫度保持28℃±2℃，觀察7 d后再進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。試驗(yàn)期間增氧機(jī)保持開(kāi)啟，定時(shí)監(jiān)測(cè)水質(zhì)變化和鱖魚(yú)動(dòng)態(tài)。及時(shí)對(duì)攻毒死亡的鱖魚(yú)進(jìn)行剖檢觀察和細(xì)菌分離鑒定。

1.2.5 毒力基因檢測(cè) 用分離菌的DNA作為模板，參照文獻(xiàn)[7]對(duì)氣溶素(aerolysin,aerA)基因、細(xì)胞毒性腸毒素(cytotoxic enterotoxin,Act)基因、熱不穩(wěn)定性腸毒素(heat-labile enterotoxins,Alt)基因、熱穩(wěn)定性腸毒素(heat-stable enterotoxin,Ast)基因、溶血素(haemolysin A,hlyA)基因、鞭毛(flagellin,Fla)基因、核酶(DNases,Exu)基因、絲氨酸蛋白酶(serineprotease,Ser)基因、彈性蛋白酶(elastase,ahyB)基因和酯酶(lipase,Lip)基因進(jìn)行PCR檢測(cè)(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 無(wú)菌條件下取100 μL分離菌菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，按照KB藥敏紙片法將17種藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基，每種藥物重復(fù)3次，每個(gè)培養(yǎng)基的藥敏紙片不超過(guò)4片。28℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI 2016)抗微生物藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)分離菌進(jìn)行判定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌形態(tài)觀察及生化特性分析

從病變明顯的鱖魚(yú)潰瘍組織分離到一株優(yōu)勢(shì)菌(ZQ202010)，在有氧和厭氧條件下生長(zhǎng)良好，在血平板上形成乳白色、邊緣整齊、光滑微隆起的菌落，無(wú)溶血現(xiàn)象(圖1A)。經(jīng)革蘭氏染色觀察，可見(jiàn)形態(tài)一致、單個(gè)或成對(duì)排列的陰性短桿菌(圖1B)。生化特性鑒定結(jié)果顯示，該分離菌具有運(yùn)動(dòng)性，賴氨酸脫羧酶、氧化酶、蔗糖、D-葡萄糖、甘露醇、VP、尿素和吲哚反應(yīng)呈陽(yáng)性；精氨酸水解酶、乳糖、木糖、硫化氫、乙酰胺和苯丙氨酸反應(yīng)呈陰性。結(jié)合細(xì)菌形態(tài)特征和生理生化反應(yīng)結(jié)果可初步判定分離菌為維氏氣單胞菌。

圖1 分離菌菌落形態(tài)(A)和革蘭氏染色(B)(1 000×)Fig.1 The morphological characteristics of isolated strain(A)and Gram staining(B)(1000×)

2.2 細(xì)菌16S rRNA及gyr B基因序列分析

用細(xì)菌16S rRNA通用引物和維氏氣單胞菌gyrB基因特異性引物對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示在1 500 bp和746 bp處分別出現(xiàn)清晰條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶(圖2)。對(duì)PCR純化產(chǎn)物分別進(jìn)行克隆測(cè)序，16S rRNA基因測(cè)序獲得1 443 bp大小的序列，與GenBank中登錄的參考菌株序列進(jìn)行比對(duì)，分離菌株與維氏氣單胞菌同源性均>99%，其中與LTJC株(登錄號(hào)：MW116753.1)、LS-912株(登錄號(hào)：MG063196.1)和LTFS2株(登錄號(hào)：MW116758.1)同源性高達(dá)100%。gyrB基因測(cè)序后得到714 bp的序列，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，分離菌株的gyrB基因與維氏氣單胞菌gyrB基因的同源性>99%。運(yùn)用MEGA7.0軟件對(duì)分離菌株的16S rRNA基因和gyrB基因分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3、圖4)，可見(jiàn)分離菌株與維氏氣單胞菌處于同一分支，說(shuō)明分離菌為維氏氣單胞菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ；1.16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照；3.gyr B基因擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000;1.Amplification product of 16S rRNA gene;2.Negative control;3.Amplification product of gyr B gene圖2 分離菌16S rRNA基因和gyr B基因PCR擴(kuò)增凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of PCR amplification of isolate 16S rRNA and gyr B genes

圖3 分離菌株ZQ202010與參考菌株16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene between isolated strain ZQ202010 and reference strains

圖4 分離菌株ZQ202010與參考菌株gyr B基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on gyr B gene between isolated strain ZQ202010 and reference strains

2.3 人工感染試驗(yàn)

攻毒8 h后，試驗(yàn)組鱖魚(yú)均出現(xiàn)游動(dòng)遲緩、水面漂浮現(xiàn)象，對(duì)照組未見(jiàn)異常。攻毒12 h后，試驗(yàn)組鱖魚(yú)接連出現(xiàn)死亡；對(duì)照組無(wú)死亡現(xiàn)象(表2)。死亡鱖魚(yú)接種部位出現(xiàn)不同程度潰瘍，與自然發(fā)病一致；無(wú)菌條件下剖檢試驗(yàn)組鱖魚(yú)，可見(jiàn)腸道透明腫脹，充滿淡黃色分泌物，腹腔少量積液。挑取鱖魚(yú)潰瘍處組織和腸道內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，均分離到與ZQ202010一致的維氏氣單胞菌。說(shuō)明分離菌株具有較強(qiáng)的致病力，是導(dǎo)致該養(yǎng)殖場(chǎng)鱖魚(yú)大量死亡的病原。參見(jiàn)表2 計(jì)算ZQ202010對(duì)鱖魚(yú)的半數(shù)致死量為4.09×106CFU。

表2 鱖魚(yú)接種分離菌株ZQ202010的半數(shù)致死量測(cè)定Table 2 Determination ofLD50 of Siniperca chuatsi inoculated with strain ZQ202010

2.4 毒力基因檢測(cè)

對(duì)分離株ZQ202010的aerA、Act、Alt等10個(gè)毒力基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該分離株攜帶aerA、Alt、Fla、Exu、Ser、ahyB和Lip共7個(gè)毒力基因，經(jīng)克隆測(cè)序鑒定與目的基因一致，但沒(méi)檢測(cè)到Act、Ast和hlyA毒力基因(圖5)。進(jìn)一步說(shuō)明分離株ZQ202010具有較強(qiáng)毒力。

M.DNA Marker DL 2 000;1-10.Alt,ahy B,Fla,aer A,Ast,hly A,Lip,Ser,Exu,Act圖5 分離菌株毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplification results of virulence genes of isolated strain

2.5 藥敏試驗(yàn)

采用17種藥敏片對(duì)分離菌ZQ202010進(jìn)行藥物敏感性測(cè)試，結(jié)果表明分離株對(duì)頭孢拉定、替米考星、頭孢曲松、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素等5種藥物敏感；對(duì)阿米卡星、大觀霉素、新霉素和慶大霉素中度敏感；對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、青霉素、阿莫西林/克拉維酸、恩諾沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、利福平和氧氟沙星等8種藥物產(chǎn)生耐藥(表3)。

表3 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Drug sensitivity test results of isolated strain

3 討論

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)為革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，對(duì)環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，廣泛存在于淡水環(huán)境，夏、秋季節(jié)其繁殖最快。免疫力降低或體表有創(chuàng)傷的水生動(dòng)物更容易感染A.veronii[8]。研究表明[9-10]，A.veronii已成為一種重要的人、獸、水生生物共患的病原菌，其不但感染魚(yú)類、爬行動(dòng)物和兩棲動(dòng)物，也可感染包括人在內(nèi)哺乳動(dòng)物，特別是老年人、兒童及免疫力低下的人群，不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來(lái)，A.veronii感染水生生物的病例越來(lái)越多，可導(dǎo)致大口黑鱸(Micropterussalmoides)[11]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[12]、湘華鯪[Sinilabeodecorustungting(Nichols)][4]、草魚(yú)(Grasscarp)[6]、錦鯉 (Cyprinuscarpio)[13]等數(shù)種水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物遭受嚴(yán)重病害，引發(fā)魚(yú)類出血、皮膚潰爛、眼球突出、腸炎及腹水等癥狀[14]，應(yīng)引起足夠重視。

本試驗(yàn)分離的維氏氣單胞菌攜帶氣溶素、熱不穩(wěn)定性腸毒素、鞭毛、核酶、絲氨酸蛋白酶、彈性蛋白酶及脂酶等毒力基因，經(jīng)動(dòng)物回歸試驗(yàn)證明該分離菌具有較強(qiáng)的致病力，可引起鱖魚(yú)皮膚潰瘍、腸道炎癥等病理變化。藥敏試驗(yàn)顯示，分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、青霉素、阿莫西林/克拉維酸、恩諾沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、利福平和氧氟沙星等8種藥物產(chǎn)生耐藥，其中恩諾沙星耐藥明顯，這可能與恩諾沙星在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中使用較多有關(guān)；對(duì)阿米卡星、大觀霉素、新霉素和慶大霉素中度敏感；對(duì)頭孢拉定、替米考星、頭孢曲松、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素等藥物高度敏感。針對(duì)本次發(fā)病鱖魚(yú)實(shí)際情況，本研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合臨床治療經(jīng)驗(yàn)建議接連換水2次，每次換水量為20%，再利用過(guò)硫酸氫鉀進(jìn)行改底，用有機(jī)酸和維生素C全池潑灑，4 h后用替米考星進(jìn)行治療；第2天鱖魚(yú)死亡量迅速減少，由疾病暴發(fā)當(dāng)天死亡量1 264尾減少到12尾；第2天鱖魚(yú)基本恢復(fù)正常。

維氏氣單胞菌致病性的強(qiáng)弱與多種毒力因子的表達(dá)、分泌相關(guān)，如外毒素、腸毒素、胞外蛋白酶和各種黏附因子等[15]。維氏氣單胞菌外毒素中，氣溶素(aer A)具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性、溶血性和腸毒性，對(duì)細(xì)胞具有很強(qiáng)的裂解作用，aer A缺失株對(duì)斑馬魚(yú)(Daniorerio)的死亡率明顯下降，aerA是維氏氣單胞菌致病性的關(guān)鍵毒力基因[16]。aerA檢測(cè)的有無(wú)并不能代表氣單胞菌的毒力強(qiáng)弱，攜帶aerA基因的維氏氣單胞菌未必能夠產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，據(jù)此推測(cè)aerA基因可能與其他毒力基因存在相互作用關(guān)系，這與劉小芳[14]的觀點(diǎn)一致。腸毒素包括細(xì)胞毒性腸毒素(Act)、熱不穩(wěn)定性腸毒素(Alt)和熱穩(wěn)定性腸毒素(Ast)，其中Act具有溶血活性、細(xì)胞毒性和腸毒性，Alt和Ast雖沒(méi)有溶血和溶細(xì)胞活性,但能夠增加腸上皮細(xì)胞cAMP和前列腺素的水平[17]。氣單胞菌能夠產(chǎn)生多種蛋白酶，其中胞外蛋白酶是重要的致病因子，包括脂肪酶、DNA酶、絲氨酸蛋白酶、彈性蛋白酶、酪蛋白酶、淀粉酶、溫度敏感性蛋白酶和卵磷脂酶。本試驗(yàn)中的分離菌株檢測(cè)到aerA、Alt、Fla、Exu、Ser、ahyB和Lip基因，并結(jié)合動(dòng)物致病性試驗(yàn)，進(jìn)一步說(shuō)明分離菌株具有一定的致病性。但維氏氣單胞菌對(duì)鱖魚(yú)的具體致病機(jī)理和傳播途徑仍有待進(jìn)一步研究。