蝦源副溶血性弧菌PirB蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

邢廣旭，孫雪峰，錢祁昇，張運尚，閆茂倉

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室，河南鄭州 450002；2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江溫州 325005)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，VP)為弧菌屬革蘭氏陰性兼性厭氧，廣泛分布于海洋、河口及海灣，是天然和人工養(yǎng)殖動物的病害源之一，其致病菌株感染可導(dǎo)致多種動物發(fā)病，不僅影響動物的生長發(fā)育，還會威脅人類健康。副溶血性弧菌作為水產(chǎn)品疫源性的主要污染源，一直以來被嚴格監(jiān)測[1-2]。在養(yǎng)殖的魚類[3]、貝類[4-5]、甲殼類[6-7]中均有副溶血性弧菌感染致病的報道。蝦源副溶血性弧菌是一種嚴重危害養(yǎng)蝦業(yè)的重要致病菌，可導(dǎo)致蝦苗早期發(fā)病，一般感染放養(yǎng)后7 d～30 d的蝦苗，主要引起蝦肝胰腺等組織損壞，造成肝功能紊亂及消化系統(tǒng)障礙[8]，臨床表現(xiàn)為病蝦體色發(fā)白、蝦殼變軟、肝胰腺顏色暗淡蒼白或糜爛發(fā)紅等[9-11]；基于該病引起的組織病理學(xué)特征將其定義為急性肝胰腺壞死綜合癥，亦稱為“急性肝胰腺壞死病”、“偷死綜合征”或“早期死亡綜合征”。由蝦源副溶血性弧菌引發(fā)的急性肝胰腺壞死病是一種全球性的對蝦傳染性疾病，造成了對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)巨大損失。特異性副溶血性弧菌致病性存在相關(guān)質(zhì)體pVA1，該質(zhì)體帶有殺昆蟲毒素(photorhabdus insect-related，Pir)PirA和 PirB，且該毒素與桿菌屬相關(guān)副溶血性弧菌攜帶的毒素蛋白PirA和PirB，且該毒素與桿菌屬相關(guān)副溶血性弧菌攜帶的毒素蛋白PirA和PirB均是引起急性肝胰腺壞死綜合癥的關(guān)鍵，其毒性基因pirA和pirB多見于質(zhì)粒[12]。本研究采用單克隆抗體技術(shù)，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達重組PirB蛋白并制備單克隆抗體，以期為蝦源副溶血性弧菌引發(fā)疾病的臨床診斷提供重要的生物材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Balb/c小鼠,雌性，6周齡～8周齡，購自濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司。

1.1.2 主要試劑 載體pET-28a、大腸埃希氏菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、HRP-羊抗鼠IgG抗體、DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶、BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Maker、切膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑，Sigma公司產(chǎn)品；AEC酶底物試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；胎牛血清，Ginco公司產(chǎn)品；SP2/0骨髓瘤細胞，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室保存。

1.1.3 主要儀器 移液搶，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR擴增儀，德國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀和全自動洗板機美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；高速臺式離心機 ，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；全自動多功能酶標儀，德國BMG公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋公司產(chǎn)品；超聲波細胞破碎儀，美國Sonics公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PirB重組蛋白表達載體的構(gòu)建 根據(jù)蝦源副溶血性弧菌PirB基因序列(GenBank:CAQ85805.1)設(shè)計引物，同時在引物上下游分別插入BamHⅠ和XholⅠ酶切位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒，目的片段長度為1 314 bp，引物為：上游引物：5′-GGATCCATGACCAACGAATACGTGGT-3′，下游引物：5′-CTCGAGTTTTTCGGTGCCGAATTCGT-3′。以重組質(zhì)粒為模板，通過PCR反應(yīng)擴增PirB基因。反應(yīng)體系 ：2× PCRTaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，模板1 μL，共25 μL體系。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 35 s,56℃ 30 s,72℃,80 s，共30個循環(huán)；最后72℃ 10 min。用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，將擴增產(chǎn)物進行切膠回收。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化加入大腸埃希氏菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，加入到含氨芐青霉素(Amp，終濃度為100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)化，待培養(yǎng)至對數(shù)期時進行雙酶切鑒定。

1.2.2 PirB重組質(zhì)粒在大腸埃希菌中的誘導(dǎo)及表達 取適量的LB液體培養(yǎng)基，按照1∶100加入轉(zhuǎn)化后含有PirB重組表達載質(zhì)粒的菌液和Amp(終濃度為100 μg/mL)，37℃、180 r/min復(fù)蘇培養(yǎng)2 h～4 h；離心去上清，重懸菌體，增菌培養(yǎng)；加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，終濃度為1 mmol/L)，30℃誘導(dǎo)表達8 h；收集誘導(dǎo)過的菌液6 000 r/min離心，離心10 min，去上清，使用磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，pH8.0)洗滌沉淀2次；沉淀加入20 mL的PBS緩沖液，在冰上超聲破碎，工作5 s，停止10 s，共工作20 min；隨后13 000 r/min、4℃離心15 min，用0.45 μm的濾器過濾，收集上清液進行SDS-PAGE。

1.2.3 重組PirB蛋白的純化和鑒定 取細菌裂解上清液進行鎳柱純化，分別用不同濃度的咪唑溶液(濃度分別為10、20、100、200、300、500 mmol/L)對目的蛋白進行洗脫，洗脫液進行SDS-PAGE，確定最佳的咪唑洗脫濃度。

用Western blot對純化后的PirB蛋白進行鑒定,將純化后的PirB蛋白與5×Loading buffer按照4∶1的體積混勻后，100℃加熱10 min，離心，取上清點樣，每個樣品終點樣量為30 μg，裝好電泳系統(tǒng)，200 V電壓，溴酚藍剛跑出分離膠時停止電泳；卸下膠板，進行轉(zhuǎn)膜，使用PBST洗滌；加入蝦源副溶血性弧菌陽性血清，37℃孵育1 h后用PBST洗滌，加入HPR-羊抗鼠IgG抗體，37℃孵育1 h；用PBST洗滌后，加入顯色液靜置5 min后放入凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.4 小鼠免疫 小鼠免疫以重組蛋白PirB作為免疫原，隨機選取6周齡～8周齡Balb/c小鼠為設(shè)置免疫組和對照組，免疫組注射免疫原(約含重組蛋白75 μg)，對照組注射等體積PBS。首次免疫將重組蛋白與弗氏完全佐劑等量混勻，乳化后在小鼠頸背部皮下多點注射。間隔21 d，進行第2次免疫；間隔21 d后，進行第3次免疫。第2次免疫和第3次免疫的具體操作方法和劑量同首次免疫。

1.2.5 雜交瘤細胞株的融合和篩選 參考經(jīng)典PEG融合法[13]，將免疫后小鼠的脾細胞與SP2/0細胞按5∶1比例制備雜交瘤細胞，然后采用間接ELISA方法確定產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞株。初步篩選出陽性雜交瘤細胞，再選擇強陽性細胞采用有限稀釋法重復(fù)亞克隆3次，使克隆化細胞板的陽性率達到100%，進行間接免疫熒光檢測。

1.2.6 單克隆抗體制備和抗體效價的檢測 取適量PBS溶液重懸離心后的陽性雜交瘤細胞，腹腔注射至致敏小鼠體內(nèi)，1周后待小鼠腹部腫脹隆起，無菌采集腹水，8 000 r/min離心20 min后取上清留上清，用PBS稀釋上清，放置于PBS緩沖液中透析，3 000 r/min離心，將上清加入飽和硫酸銨溶液中進行純化。純化后的抗體采用間接ELISA法檢測效價，以免疫小鼠血清為陽性對照，以SP2/0細胞腹腔注射制備的腹水為陰性對照和空白對照，結(jié)果判定以P/N>2.1時腹水的最大稀釋倍數(shù)即腹水效價。

1.2.7 單克隆抗體特異性分析 以PirB蛋白作為抗原，抗PirB單克隆抗體作為一抗，HRP-羊抗鼠作為二抗，抗原包被液為空白對照，免疫前小鼠血清為陰性對照；以白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、黃頭病病毒(Yellow head disease，YHV)和偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus，CMNV)，分別作為特異性分析的病原，采用間接ELISA法檢測對單克隆抗體進行特異性分析。

2 結(jié)果

2.1 PirB重組蛋白表達載體鑒定結(jié)果

以蝦源副溶血性弧菌PirB重組質(zhì)粒為模板，加入引物與酶后進行PCR擴增得到PirB基因片段，經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，在1 300 bp出現(xiàn)目的條帶，表明本研究成功構(gòu)建PirB重組質(zhì)粒。

M.DNA標準DL 10 000；1.重組載體M.DNA Maker DL 10 000;1.Recombinat plasmid圖1 PirB重組蛋白鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of PirB recombinant protein

2.2 PirB重組質(zhì)粒在大腸埃希菌中的誘導(dǎo)及表達

將PCR產(chǎn)物與載體連接后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞進行表達(圖2)，結(jié)果表明，30℃誘導(dǎo)表達8 h表達量多，為最適條件。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.未誘導(dǎo)；2.誘導(dǎo)；3～6.16℃誘導(dǎo)2、4、6、8 h；7～10.25℃誘導(dǎo)2、4、6、8 h；11～14.30℃誘導(dǎo)2、4、6、8 h；15～18.37℃誘導(dǎo)2、4、6、8 hM.Protein molecular weight Marke;1.No induction;2.Induction;3-6.16℃induction 2,4,6,8 h；7-10.25℃induction 2,4,6,8 h；11-14.30℃induction 2,4,6,8 h；15-18.37℃ induction 2,4,6,8 h圖2 PirB蛋白誘導(dǎo)表達條件摸索Fig.2 Exploring the expression conditions of PirB protein

2.3 PirB蛋白的純化和鑒定

取超聲破碎后的菌液上清和沉淀進行電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PirB蛋白主要存在于細菌裂解液上清中。取細菌裂解上清液進行鎳柱純化，分別用不同濃度的咪唑溶液(濃度分別為10、20、100、200、300、500 mmol/L)對目的蛋白進行洗脫，濃度為100 mmol/L咪唑可將目的蛋白進行有效洗脫(圖3)。對純化后的PirB蛋白進行Western blot鑒定，在55 ku位置出現(xiàn)目的條帶(圖4)。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.上清液；2.沉淀；3～8.10 mmol/L～500 mmol/L咪唑洗脫；9.空載M.Protein molecular weight Marke;1.Supernatant;2.Precipitate;3-8.Elutions with different concentrations of imidazole;9.Empty vector圖3 PirB蛋白純化條件摸索Fig.3 Exploring the purification conditions of PirB protein

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.空載；2.PirB蛋白M.Protein molecular weight Marke;1.Empty vector;2.PirB protein圖4 PirB蛋白純化鑒定結(jié)果Fig.4 Identification results of PirB protein purification

2.4 PirB蛋白免疫動物血清ELISA效價測定

采用1.2.4所述免疫方法免疫Balb/c小鼠，三免后用酶標儀測定450 nm處的吸光度值(OD)。以 OD陽性/OD陰性>2.1的最高稀釋倍數(shù)作為該血清的效價。小鼠血清的ELISA效價見表1，血清稀釋倍數(shù)達到1∶51 200時，P/N為2.4，達到細胞融合試驗的小鼠抗體水平，可用于下一步試驗。

表1 間接ELISA測定單克隆抗體效價結(jié)果Table 1 Determination of monoclonal antibody titters by indirect ELISA

將篩選出的陽性雜交瘤細胞注射入小鼠腹腔，收集腹水進行間接ELISA檢測，結(jié)果見表2，已篩選出7株雜交瘤細胞效價較高，分別命名為3E4、33C8、36B3、42D11、43F2、55G5、81C9，其中36B3效價最高，達到1∶2.56×106。

表2 間接ELISA檢測腹水PirB效價結(jié)果Table 2 Detection of PirB titer in ascites by indirect ELISA

2.5 單克隆抗體的特異性試驗

將白斑綜合征病毒(WSSV)、黃頭病病毒(YHV)、偷死野田村病毒(CMNV)與蝦源副溶血性弧菌病原包被酶標板，用單克隆抗體進行間接ELISA檢測，統(tǒng)計單克隆抗體的特異性反應(yīng)率，結(jié)果如表3所示，表明制備的單克隆抗體具有良好的特異性，可以用于蝦源副溶血性弧菌的檢測。

表3 單克隆抗體的特異性Table 3 Specificity of monoclonal antibody

3 討論

蝦源副溶血性弧菌是近年來全球性對蝦急性肝胰腺壞死病暴發(fā)的主要病原，一直被受關(guān)注，對其污染狀況、致病性、耐藥性以及定量風(fēng)險評估[14-17]等進行一系列的研究，認為控制養(yǎng)殖過程中的副溶血性弧菌對養(yǎng)殖成功率至關(guān)重要。實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，蝦被副溶血性弧菌感染后引起的病蝦體色發(fā)白、蝦殼變軟、肝胰腺顏色暗淡蒼白或糜爛發(fā)紅等病癥，與環(huán)境應(yīng)激、微孢子蟲[18-19]、白斑綜合征病毒[20]等引起的癥狀十分相似，臨床上觀察到的主要癥狀無法從根本上對病因進行準確判斷，必須通過實驗室檢測分析。因此，及時、快速、準確的發(fā)現(xiàn)蝦源副溶血性弧菌，對于防控這種致病菌是非常有必要的。

蝦源副溶血性弧菌的檢測和鑒定主要采用細菌生化鑒定、血清學(xué)分型、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定和PCR方法[21]。PCR方法主要有TaqMan-MGB探針熒光定量PCR法、雙重PCR法[22]、套式PCR法[23]等。PCR檢測所用的引物為AP1-AP4[23]、TUMSAT-Vp3、VpPirA-284和VpPirB-392中的一種，該方法具有較好的準確性和靈敏性。但是該方法存在人員水平和儀器設(shè)備要求高、擴增產(chǎn)物和核酸提取中標本間的交叉污染問題，以及標本或核酸純化過程中出現(xiàn)的擴增反應(yīng)抑制物、擴增儀孔間溫度的差異以及核酸提取中的隨機誤差等缺點，使得該方法在臨床應(yīng)用和疾病篩查方面存在諸多不便。

單克隆抗體技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、交叉反應(yīng)少的特點，被廣泛應(yīng)用于各種病原的免疫學(xué)檢測，尤其適合樣品大批量快速篩查。本研究采用單克隆抗體技術(shù)，利用PirB基因序列通過PCR擴增后構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后利用桿狀病毒表達系統(tǒng)對PirB蛋白進行表達，純化后用于免疫小鼠制備脾細胞。通過間接ELISA進行篩選，確保篩選到分泌與毒素蛋白PirB具有特異性反應(yīng)抗體的雜交瘤細胞并用于制備腹水，獲得特異性較強的單克隆抗體，為蝦源副溶血性弧菌的監(jiān)測與防控提供了技術(shù)支持以及進一步研究PirB的功能奠定了一定的基礎(chǔ)，對于蝦源副溶血性弧菌引發(fā)的疫病的防控以及養(yǎng)蝦業(yè)的發(fā)展具有一定的意義。