豬戊型肝炎病毒4型感染新西蘭大白兔肝臟和腦組織中IL-4與IL-5的表達

楊莎莎，王 源，張以芳，鄭曉林，彭海芬，吳俊達，王國君，李文貴

(云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南昆明 650201)

戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的糞-口途徑傳播疾病，是全球主要的病毒性肝炎之一。目前已發(fā)現(xiàn)HEV的7種基因型，具有擴大宿主范圍和跨種感染的潛力，有大量研究表明，基因3和4型會引起人畜共患性感染[1]，豬的3型和4型HEV病毒株會經(jīng)糞-口途徑傳給人類[2]，在世界范圍內(nèi)引起戊型肝炎的散發(fā)。

體液免疫和細胞免疫在機體抗病毒感染中均發(fā)揮著重要的作用，目前,關(guān)于HEV感染后的細胞免疫應(yīng)答的研究相對較少。為更好地了解在 HEV感染中的細胞免疫應(yīng)答機制，本研究以新西蘭大白兔為動物模型，采用腹腔注射方式感染豬源HEV[3]，對感染不同時期的兔子肝臟、腦組織內(nèi)的白細胞介素4(interleukin 4，IL-4)和白細胞介素5(interleukin 5，IL-5)的表達進行研究，為進一步深入探討HEV的感染機制，制定相應(yīng)的防控措施提供新的研究思路和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3月齡～4月齡的雄性新西蘭大白兔共15只，HEV抗體檢測為陰性。

1.1.2 HEV陽性樣品 采自昆明周邊豬場的2月齡～3月齡仔豬新鮮糞便，檢測為HEV RNA陽性的樣品，用5 mL離心管盛放并保存于-80℃超低溫冰箱。

1.1.3 主要試劑 RNA提取試劑(TRIzol)、DNA Marker DL 1 000 、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒(離心柱型)、兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trans HIFI PCR MIX，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Prime Script RT?reagents kit(反轉(zhuǎn)錄試劑)、SYBR?Prime ExTaqT Ⅱ(熒光染料)，TaKaRa公司產(chǎn)品；豬戊型肝炎病毒IgG抗體試劑盒，北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；多聚甲醛、HE染液等為國產(chǎn)試劑。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 PCR擴增儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；電泳儀和水平板電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司產(chǎn)品；石蠟切片機，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；生物組織包埋機，浙江省科迪儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；生物倒置顯微鏡，OLYMPUS公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品；核酸定量儀，上海嘉鵬科技有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機，德國SiGma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒懸液的制備 將凍存于-80℃冰箱的HEV陽性糞便樣品用生理鹽水4℃過夜浸毒，4℃下3 000 r/min離心30 min，經(jīng)0.22 μm濾器過濾后加入1%雙抗，備用。

1.2.2 攻毒及采樣 新西蘭大白兔隨機分為2組，攻毒組10只，對照組5只，用北京萬泰藥業(yè)有限公司HEV ELISA試劑盒檢測血清中HEV抗體和反轉(zhuǎn)錄套式PCR(RT-nPCR)檢測HEV核酸，結(jié)果全為陰性。單獨隔離飼養(yǎng)。

試驗組每只新西蘭大白兔經(jīng)腹腔注射10 mL豬HEV陽性樣品懸液，對照組每只注射等量的生理鹽水,攻毒后從第3天(3 dpi)開始固定時間采集實驗動物的糞便樣品，用高壓滅菌的5 mL離心管盛放并保存于-80℃冰箱保存，分別于7、14、21、28、35 dpi處死攻毒組2只、對照組1只，分別采取心、肝、脾、肺、腎、腸、腦樣本，一部分用高壓滅菌的5 mL離心管盛放并保存于-80℃?zhèn)溆?，一部分?0 mL/L多聚甲醛溶液固定用于組織病理學檢查。

1.2.3 組織病理學觀察 取固定的組織材料制作切片，利用蘇木素-伊紅(HE)染色，用顯微鏡對染色完成的切片進行觀察。

1.2.4 感染的確認及相關(guān)炎癥細胞因子的檢測

1.2.4.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中各基因序列，參考文獻選擇引物并由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成(表1)。

表1 試驗中用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4.2 兔子糞便及組織總RNA 的提取 使用RNA提取試劑(TRIzol)提取總RNA。

1.2.4.3 cDNA的合成及RT-nPCR擴增目的片段 利用全式金兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。第1輪PCR反應(yīng)體系為2×TransTaqTm HiFi PCR SuperMix II 10 μL，HEV-1 和HEV-4(25 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 2 μL，加入RNase free water將總體積調(diào)至20 μL。循環(huán)參數(shù)為:94℃ 2 min；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s,35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。取第1輪PCR產(chǎn)物(稀釋50倍)1 μL作為模板，HEV-2和HEV-3(25 μmol/L)各0.5 μL，其他成分與第1輪相同，用RNase free water將總體積調(diào)至20 μL。反應(yīng)條件將內(nèi)循環(huán)改為25個循環(huán)，其他與第1輪相同。

1.2.4.4 PCR產(chǎn)物檢測 配制15 g/L瓊脂糖凝膠，加入終濃度為0.5 μg/mL的溴化乙錠(EB)。取5 μL PCR產(chǎn)物與Loading buffer混合后加入點樣孔，以1×TAE為電泳緩沖液，120 V電泳30 min后，凝膠成像系統(tǒng)下觀測結(jié)果，出現(xiàn)137 bp條帶的樣品則為陽性。

1.2.4.5 cDNA的合成及實時熒光定量PCR 利用核酸蛋白儀測定核酸的質(zhì)量和純度，配制反轉(zhuǎn)錄體系：5×PrimeScript buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 0.5 μL，Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μL，總RNA 500 ng，用RNase free water 補足10 μL。置PCR儀中37℃ 15 min，85℃ 30 s滅活反轉(zhuǎn)錄酶，冷卻后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Real-time PCR反應(yīng)體系：SYBR?Prime ExTaqTM12.5 μL，Mx1F (10 μmol/L)0.5 μL，Mx1R (10 μmol/L)0.5 μL，cDNA1 μL ，RNase free water 10.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 30 s，60℃ 5 s，共35個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 感染確認

2.1.1 糞便RT-nPCR結(jié)果 將HEV-4經(jīng)腹腔接種新西蘭大白兔，在攻毒第3天開始可以在糞便中檢測到HEV。在感染的第3、5、7、14、28天均可以檢測到病毒，但部分兔感染初期在糞便檢測不到病毒，說明新西蘭大白兔有間歇性排毒現(xiàn)象(圖1)。

M.DNA標準DL 1 000；1.陰性對照；2～6.5個樣品檢測結(jié)果M.DNA Marker DL 1 000;1.Negative control;2-6.5 Sample test results圖1 糞便中HEV PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(3 dpi)Fig.1 Electrophoresis results of HEV PCR products in feces(3 dpi)

2.2 組織病理學觀察

2.2.1 肝臟 對照組兔肝臟在試驗期內(nèi)未見明顯病變，肝臟結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞排列整齊。感染后第7天試驗組兔肝臟出現(xiàn)肝小葉間淋巴細胞浸潤、肝細胞顆粒變性；接種第14天肝臟中出現(xiàn)局灶性淋巴細胞浸潤、肝細胞索排列紊亂、肝竇淤血；肝細胞變性、壞死，枯否細胞增多(圖2)。

A.中央靜脈淋巴細胞浸潤(HE 200×)；B.肝細胞變性，中央靜脈淤血(HE,200×)；C.肝竇淤血(HE 200×)；D.中央靜脈大量細胞滲出 (HE 400×)A.Central vein lymphocyte infiltration(HE 200×);B.Hepatocyte degeneration,central venous congestion;(HE 200×);C.Hepatic sinus congestion(HE 200×);D.Central venous massive red blood cell exudation(HE 400×)圖2 肝臟組織學病變(14 dpi)Fig.2 Liver histopathological lesions(14 dpi)

2.2.2 腦 對照組兔腦未見明顯病變。試驗組兔腦膜血管擴張，淤血并伴有腦膜出血；腦膜的分子層內(nèi)小膠質(zhì)細胞増生；血管周圍淋巴細胞浸潤，形成管套袖現(xiàn)象；腦室周圍組織發(fā)生液化性壞死，形成空泡樣疏松結(jié)構(gòu)，伴有炎性細胞浸潤；神經(jīng)細胞壞死，小膠質(zhì)細胞浸潤吞噬神經(jīng)細胞(圖3)。

2.3 IL-4和IL-5 Real-time PCR檢測結(jié)果

2.3.1 肝臟中各細胞因子檢測結(jié)果 Real-time PCR檢測不同感染時期兔肝臟中IL-4和IL-5基因表達水平，結(jié)果顯示，IL-4在第7天mRNA轉(zhuǎn)錄水平比對照組高；從第14天開始轉(zhuǎn)錄水平降低，直至第35天恢復與對照組一致。IL-5在第7天mRNA轉(zhuǎn)錄水平比對照組高；第14天轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降，但依然高于對照組，直至第35天降低至對照組數(shù)值附近(表1、圖4)。

表1 肝臟中IL-4和IL-5 mRNA檢測結(jié)果Table 1 Detection results of IL-4 and IL-5 mRNA in liver

A.空泡樣(HE 200×)；B.膠質(zhì)細胞浸潤 (HE 400×)；C.管套袖現(xiàn)象 (HE 400×)；D.腦膜出血 (HE 400×)A.Vacuolar-like(HE 200×);B.Glial cell infiltration(HE 400×);C.Vascular cuff(HE 400×);D.Meningeal hemorrhage;(HE 400×)圖3 腦組織病理學病變Fig.3 Brain histopathological lesions

2.3.2 腦組織各細胞因子檢測結(jié)果 Real-time PCR檢測不同感染時期兔腦中IL-4和IL-5基因表達水平，檢測結(jié)果顯示，腦中IL-4的轉(zhuǎn)錄水平在感染初期就明顯降低，第28天達到最低值，只有對照組的10%左右，第35天轉(zhuǎn)錄水平恢復至正常水平。IL-5在感染初期下調(diào)，第14天上調(diào)，在第35天恢復至正常水平(表2、圖4)。

圖4 肝臟及腦中IL-4和IL-5 mRNA表達Fig.4 The expressions of IL-4 and IL-5 mRNA in liver and brain

表2 腦中IL-4和IL-5 mRNA檢測結(jié)果Table 2 Detection results of IL-4 and IL-5 mRNA in brain

3 討論

目前，對HE的致病機理和免疫機制的認識尚淺。有研究表明T細胞和自然殺傷(NK)細胞在介導HEV感染免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，所分泌的細胞因子IL-4參與了免疫應(yīng)答。IL-4的生物作用包括刺激活化B細胞和T細胞增殖、CD4+T細胞分化成Ⅱ型輔助T細胞(Th2)，它也在調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用。有研究表明，IL-4與肝臟的炎癥及纖維化形成有關(guān)系[6]。IL-5主要由活化的Th2細胞分泌產(chǎn)生，自然殺傷細胞、肥大細胞、B細胞均可產(chǎn)生，IL-5在免疫系統(tǒng)及維持機體生理平衡上發(fā)揮著重要作用，它的分泌或基因表達異常往往導致或促進疾病的發(fā)生。然而，目前在HEV感染導致的機體損傷中的IL-5 mRNA表達水平狀況了解甚少。

IL-4和IL-5屬于Th2類細胞因子，T細胞介導的免疫反應(yīng)與多種肝病的發(fā)病機制有關(guān)[7]。T細胞在肝臟中的免疫作用是通過多種細胞因子的釋放來介導的，這些細胞因子通過多種信號級聯(lián)的激活來靶向肝細胞和免疫細胞。在本次研究中發(fā)現(xiàn)HEV人工感染新西蘭大白兔后，Real-time PCR檢測到感染初期肝臟中IL-4表達水平明顯上升，高于對照組。這與張劍英的研究結(jié)果一致[8]。IL-4水平的升高可以抑制Th1細胞因子的產(chǎn)生，促進 Th2細胞因子的表達，從而減輕肝細胞損傷，對機體的免疫功能和炎癥過程具有重要的調(diào)節(jié)活性。在各種肝損傷模型中已證明IL-4有保護性和有害性，注射IL-4可減輕肝臟缺血/再灌注損傷[9]。在本試驗中，感染第7天肝臟中的IL-4表達水平最高，表明在感染早期HEV進入肝臟可引發(fā)IL-4表達增加，從而減輕肝細胞的損傷。相反，有研究表明IL-4在Con A誘導的肝炎中扮演著重要角色，其通過增強肝細胞和竇狀內(nèi)皮細胞中趨化因子的表達，并誘導IL-5表達，從而促進炎性細胞的募集進入肝臟并導致肝炎[7]。對于同一器官而言，感染后兔的肝臟中IL-4表達增加的同時IL-5的表達也升高，在感染第14天時兩者表達量同時下降但都遠高于對照組，在第35天又基本恢復與對照組一致，因此說明 IL-4和IL-5等細胞因子在HEV誘發(fā)的肝炎發(fā)展中發(fā)揮作用是合理的。

IL-5主要是由Th2細胞產(chǎn)生，能特異作用于嗜酸粒細胞凋亡的細胞因子。通過RT-PCR方法檢測急、慢性肝損傷患者PBMCs中IL-5 mRNA表達水平，結(jié)果顯示均高于健康者[10]。本研究中在感染第7天檢測到高表達水平的IL-5 mRNA，中期稍微降低但遠高于對照組，后期恢復一致。結(jié)合組織病理學觀察結(jié)果，接種第14天肝臟中出現(xiàn)局灶性淋巴細胞浸潤、肝細胞索排列紊亂、肝竇淤血；肝細胞變性、壞死，枯否細胞增多等病理損傷。這些病理變化與張閩峰等對戊型肝炎病人觀察到的肝細胞變性、灶性壞死、枯否細胞增生等特征相似[11]。結(jié)果提示IL-5促進肝臟的炎性損害，導致嚴重的肝細胞損傷，在肝損傷中扮演著重要角色。

HEV能在肝臟以外的其他器官復制增殖。本研究前期試驗表明，除肝外，病毒可存在于不同的組織器官中，感染后第7天在兔的肝臟、腦、小腸、心臟、腎、脾和肺中均可檢測到 HEV，組織病理學觀察結(jié)果顯示，感染能造成腦、心臟、腎臟等組織不同程度的病理損傷，同時，檢測感染兔子腦組織的IL-4和IL-5兩種細胞因子的表達水平，發(fā)現(xiàn)相較于對照組也有變化，有研究表明，多種細胞因子如白細胞介素和腫瘤壞死因子等介導炎癥反應(yīng)，參與繼發(fā)性腦損傷的病理生理過程[12]，但病毒感染繼發(fā)腦組織損害是一個多重因素共同參與的復雜的病理生理過程，新西蘭大白兔感染HEV-4后腦內(nèi)IL-4和IL-5的表達水平變化原因以及在介導腦組織損傷中發(fā)揮的作用還有待進一步研究。