海州常山葉片實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的內(nèi)參基因選擇

華雅潔，岳遠(yuǎn)征，楊秀蓮＊，何 卿

(1.南京林業(yè)大學(xué)，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.江蘇省環(huán)境科學(xué)研究院，江蘇省環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210036)

海州常山（Clerodendrum trichotomumThunb.），又名臭梧桐，為馬鞭草科（Verbenaceae）赪桐屬（ClerodendrumL.），灌木或小喬木，廣泛分布于我國(guó)華北、華東、中南、西南等各省區(qū)[1]。海州常山夏季花朵潔白美麗，花期較長(zhǎng)，秋冬亮藍(lán)色的果實(shí)懸掛于枝頭，是秋冬季節(jié)別具特色的觀果植物，有較好的觀賞性，且海州常山根系強(qiáng)壯，自然條件下在干旱瘠薄的砂石、石灰?guī)r山地和貧瘠的山地野生分布，栽培管理簡(jiǎn)單，具有強(qiáng)的耐鹽堿、抗旱、耐瘠薄、耐陰、抗有害氣體等能力，可作為荒地與鹽堿地的生態(tài)修復(fù)樹(shù)種[2]?？傮w來(lái)說(shuō)，海州常山是集觀賞與優(yōu)良抗性為一體的極具開(kāi)發(fā)潛力的木本花卉。

然而，現(xiàn)在對(duì)海州常山的研究主要集中于種質(zhì)資源收集[3]、快繁體系培育[4]、植物生理抗逆性[5]、藥物成分開(kāi)發(fā)[6]等，對(duì)于海州常山分子生物學(xué)的研究十分匱乏，海州常山內(nèi)參基因的篩選及表達(dá)尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)發(fā)表，連對(duì)馬鞭草科植物可穩(wěn)定使用的內(nèi)參基因篩選也是知之甚少。本研究對(duì)海州常山進(jìn)行鹽脅迫、干旱脅迫和熱害脅迫，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，并通過(guò) GeNorm、NormFinder、BestKeeper及ReFinder 軟件綜合分析，篩選出適合海州常山葉片非生物脅迫下使用的內(nèi)參基因，為海州常山深入分析分子機(jī)制研究及優(yōu)良的抗性基因開(kāi)發(fā)奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與脅迫處理

本實(shí)驗(yàn)使用了種植于南京林業(yè)大學(xué)白馬研究教學(xué)基地（119.02° E，31.65° N）海州常山種質(zhì)資源庫(kù)中鹽城種源的海州常山（鹽城種源為收集于鹽城地區(qū)的野生種，并于2015 年定植于南京林業(yè)大學(xué)白馬研究教學(xué)基地海州常山種質(zhì)資源庫(kù)）。2018年采集鹽城種源種子，種子種植于珍珠巖、蛭石、泥炭和沙子（1∶1∶1∶2）的混合物中，放置在光周期14 h、溫度25/21℃（晝/夜）、光照強(qiáng)度180 mmol·m-2·s-1、相對(duì)濕度60%的生長(zhǎng)箱（RDN-1 000-3，中國(guó)寧波東南儀器廠）中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出8 片以上真葉，取長(zhǎng)勢(shì)大致相同的1 年生實(shí)生苗進(jìn)行非生物脅迫實(shí)驗(yàn)。

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，將幼苗放入四分之一強(qiáng)度的Hoagland 培養(yǎng)基中適應(yīng)2 周，適應(yīng)過(guò)程中，海州常山幼苗未見(jiàn)不適應(yīng)情況，經(jīng)觀察幼苗還在繼續(xù)長(zhǎng)葉生長(zhǎng)，且長(zhǎng)勢(shì)良好。在進(jìn)行鹽脅迫時(shí)，將幼苗轉(zhuǎn)入含100 mmol·L-1NaCl 的Hoagland 培養(yǎng)基中；在進(jìn)行干旱脅迫時(shí)，將幼苗轉(zhuǎn)入含100 mmol·L-1PEG6000 的Hoagland 培養(yǎng)基中；在進(jìn)行熱害脅迫時(shí)，將幼苗置于45 ℃/35 ℃（晝/夜）的生長(zhǎng)室內(nèi)進(jìn)行高溫處理。各脅迫均在處理0、2、6、12、24、48 和72 h 時(shí)采取3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)植物葉片，葉片均采自于從上至下第 2 至第 4 對(duì)葉片，每次脅迫使用21 棵幼苗，采取過(guò)葉片的植物便不再作為實(shí)驗(yàn)材料再取葉片，采取后立即將葉片放入無(wú)菌無(wú)酶的離心管中并投入液氮中，放置在-80 ℃下的超低溫冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?，直?RNA 提取。所有實(shí)驗(yàn)處理及采樣均在上文所述人工培養(yǎng)箱中完成，盡量減少其他無(wú)關(guān)變量對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

1.2 RNA 提取及cDNA 合成

RNA 提取采用北京艾德萊生物有限公司的EASY spin Plus 試劑盒，用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證 RNA 的完整性，使用Mettler 公司生產(chǎn)的核酸檢測(cè)儀 UV5NANO 檢測(cè) RNA 質(zhì)量及濃度。使用北京全式金公司的 EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，-20 ℃保存。

1.3 候選內(nèi)參基因的選擇與引物合成

根據(jù)文獻(xiàn)查詢(xún)植物中常用的內(nèi)參基因，在海州常山轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找同源基因，用 NCBI 中Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）功能進(jìn)一步確認(rèn)注釋信息和比對(duì)結(jié)果，選定所需的基因。在海州常山轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找各候選基因的保守序列，根據(jù)基因保守序列用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，再用 Oligo7 進(jìn)行分析，引物設(shè)計(jì)原則參考Ding 等的方法[7]，所使用引物均在南京金斯瑞公司合成。將所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行常規(guī) PCR，并用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，按照 TaKaRa公司的 Agarose Gel Extraction Kit 凝膠回收盒對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收，連到大腸桿菌載體上并送南京金斯瑞公司測(cè)序。將測(cè)序得到的序列與所設(shè)計(jì)的序列用 DNAMAN 進(jìn)行比對(duì)，確定內(nèi)參候選基因。

1.4 qRT-PCR 反應(yīng)條件

使用 TakaRa 公司的 Ex TaqTM染料進(jìn)行 qRTPCR，熒光定量?jī)x型號(hào)為賽默飛公司的 plied Biosystems StepOne PCR System，所有 qRTPCR 反應(yīng)進(jìn)行3 次生物重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)，并與無(wú)模板陰性對(duì)照平行進(jìn)行。qRT-PCR 反應(yīng)組分體系及反應(yīng)條件如下：反應(yīng)體系共計(jì)10 μL，其中，cDNA 1 μL，ROX 0.2 μL，正向引 物 0.4 μL，反向引物 0.4 μL，SYBR 染料5 μL，ddH2O 4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 0.5 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃0.75 min，60 ℃ 0.5 min，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)，95 ℃0.25 min，60 ℃ 1 min，95 ℃ 0.25 min，1 個(gè)循環(huán)。

1.5 內(nèi)參基因特異性與擴(kuò)增效率檢驗(yàn)

以混合 cDNA 為模板，反應(yīng)體系同上文，以 5為倍數(shù)稀釋成 5 個(gè)梯度（1、1/5、1/25、1/125、1/625），作為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)3 次，同時(shí)以 ddH2O 作為陰性對(duì)照模板，來(lái)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的試劑或者人為污染。計(jì)算每對(duì)引物的擴(kuò)增效率（E=(10-1/slope-1) × 100%）。選擇溶解曲線呈現(xiàn)單峰，并且擴(kuò)增效率在 90%～110%，陰性對(duì)照無(wú)峰的特異性引物作為最終的引物。

1.6 數(shù)據(jù)分析

內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析，利用軟件 GeNorm、NormFinder 和 BestKeeper，并用在線分析工具ReFinder（http://150.216.56.64/referencegene.php）綜合分析 qRT-PCR 的數(shù)據(jù)，計(jì)算候選內(nèi)參基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)穩(wěn)定性。

NHX1基因（Na+/H+交換基因）被認(rèn)為是增強(qiáng)植物非生物脅迫耐受性的關(guān)鍵基因，尤其是耐鹽性[8]，選擇CtNHX1基因?yàn)轵?yàn)證基因（F：CACT AACAAATCCCCAACTCAT；R：CTCAAGCTCAA AGGAAAAGAAC），并用篩選出的合適的內(nèi)參基因作為參照，使用不穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為比較，驗(yàn)證候選內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 RNA 提取、內(nèi)參基因引物特異性與擴(kuò)增效率分析

樣品 RNA 的濃度使用 Mettler 公司生產(chǎn)的核酸檢測(cè)儀 UV5NANO 測(cè)定，樣本濃度均在 432～1 732 ng·mL-1之間，OD260/280值在 1.8～2.0 之間，OD260/230≥2.0，用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn) RNA 完整性，顯示至少存在2 條帶，28 S 和18 S 清晰，且 28 S/18 S ≈ 2，說(shuō)明 RNA 質(zhì)量達(dá)到熒光實(shí)時(shí)定量分析的要求。

共計(jì)篩選出 17 個(gè)候選內(nèi)參基因，對(duì) 17 個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量，基因的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為112～246 bp，溶解曲線均為單一峰，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高，符合篩選內(nèi)參基因的要求。所有候選內(nèi)參基因的E值（擴(kuò)增效率）范圍為 96.67%～99.68%，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2為 0.986～0.999，綜上所述 17 對(duì)引物的擴(kuò)增效率較高（表1）。

表1 17 個(gè)候選內(nèi)參基因引物及擴(kuò)增效率Table 1 17 candidate internal reference gene primers and amplification efficiency

2.2 候選內(nèi)參基因表達(dá)分析

基因表達(dá)水平由周期閾值（Ct）決定，Ct值與基因表達(dá)量呈反比，從圖1 中可看出：這些候選基因顯示出不同的表達(dá)水平，17 個(gè)候選參考基因的Ct值分布均在15～35 個(gè)循環(huán)之間，具體數(shù)值見(jiàn)表1。ACT、UBCE2和HSP70的表達(dá)量較高，且在不同樣本中表達(dá)變化范圍相對(duì)較小，表達(dá)較穩(wěn)定；SAND、PROF的表達(dá)量較低；APT、H3 和EF-1A在不同樣本中表達(dá)變化范圍相對(duì)較大，表達(dá)差異較大（圖1）。

圖1 17 個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct 值分布Fig.1 Distribution of Ct values of 17 candidate internal reference genes

2.3 脅迫下候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.3.1 GeNorm 分析 GeNorm 軟件根據(jù)平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)(M)確定最穩(wěn)定基因，M值的大小與基因穩(wěn)定性呈反比，M值的閾值為1.5，超過(guò)1.5 則視為不能選為內(nèi)參基因。此外，GeNorm 軟件通過(guò)配對(duì)變異值（Vn/n+1）計(jì)算最優(yōu)內(nèi)參基因的校準(zhǔn)數(shù)量，若Vn/n+1值小于0.15，則所需參考基因的數(shù)量為n，否則需引入的參考基因的數(shù)量為n+1[9]。

從表2 可看出：在鹽害、干旱和熱害脅迫中，M值均小于1.5，說(shuō)明符合GeNorm 軟件篩選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)。鹽害脅迫中，RPL和AP-2基因最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.132；干旱脅迫中，ACT和AP-2表現(xiàn)最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.401；熱害脅迫下EF-1A和UBCE2最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.247。綜合所有脅迫數(shù)據(jù)看，基因RPL和AP-2最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.767，且V2/3均小于0.15，說(shuō)明選用2 個(gè)內(nèi)參基因便可滿(mǎn)足基因標(biāo)準(zhǔn)化的要求（圖2）。

圖2 GeNorm 軟件分析的配對(duì)變異值（Vn/n + 1）Fig.2 Paired variation(Vn/n + 1) analyzed by GeNorm software

表2 GeNorm 軟件分析結(jié)果Table 2 GeNorm software analysis results

2.3.2 NormFinder 分析 NormFinder 軟件原理和GeNorm 相似[10]，通過(guò)計(jì)算穩(wěn)定值排序得出基因的穩(wěn)定性，穩(wěn)定值較大的基因，穩(wěn)定性較差。一般來(lái)說(shuō)，NormFinder 軟件只計(jì)算一個(gè)最適的內(nèi)參基因。在鹽害脅迫中，基因RPL最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.238，18S最不穩(wěn)定，穩(wěn)定值為1.283；干旱脅迫下，AP-2基因顯示最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.246，基因H3穩(wěn)定性表現(xiàn)較差，穩(wěn)定值為1.658；熱害脅迫下，MDH基因最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.155，H3表現(xiàn)出最不穩(wěn)定的特性，穩(wěn)定值為1.841；將所有脅迫實(shí)現(xiàn)綜合來(lái)看，AP-2是最穩(wěn)定的基因，穩(wěn)定值為0.317，H3是最不穩(wěn)定的基因，穩(wěn)定值為2.252（表3）?？傮w來(lái)看，基因RPL、UBCE2、AP-2、MDH等基因在各個(gè)脅迫處理中，穩(wěn)定性均排第一、第二位，相對(duì)穩(wěn)定，H3基因穩(wěn)定性總是排在較后的位置，穩(wěn)定性較差，不適合作為海州常山內(nèi)參基因使用。

表3 NormFinder 軟件分析結(jié)果Table 3 NormFinder software analysis results

2.3.3 BestKeeper 分析BestKeeper 軟件通過(guò)比較Ct值產(chǎn)生的相關(guān)系數(shù)（r）、變異系數(shù)（CV）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）來(lái)決定最優(yōu)的內(nèi)參基因，SV和SD越小，則穩(wěn)定性較好[11]，當(dāng)SD＞ 1 時(shí)，則該內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定。與NormFinder 軟件相同，BestKeeper 軟件一次只能計(jì)算一個(gè)最適的內(nèi)參基因。

在海州常山鹽害脅迫處理中，基因ACT（SD=0.26，CV=為1.37）為最穩(wěn)定的基因，干旱脅迫下最穩(wěn)定的基因也是ACT（SD=0.36，CV=1.86），在熱害脅迫下最穩(wěn)的基因是AP-2（SD=0.36，CV=1.3）；綜合分析所有脅迫下數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，AP-2基因是最穩(wěn)定的基因（SD=0.64，CV=2.73）（表4）；相比較之下，基因H3在鹽害脅迫、干旱脅迫、熱害脅迫和所有脅迫數(shù)據(jù)處理中，SD和CV值都是最大的，最不穩(wěn)定。

表4 Bestkeeper 軟件分析結(jié)果Table 4 Bestkeeper software analysis results

2.3.4 ReFinder 分析 3 個(gè)軟件分析的結(jié)果有相似也有不同，所以需要使用ReFinder 軟件綜合分析，對(duì)3 個(gè)軟件得出的基因穩(wěn)定性排名值進(jìn)行幾何平均值分析，幾何平均值越小則說(shuō)明候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性較高。運(yùn)用ReFinder 軟件綜合分析得出（表5），鹽害脅迫下，最穩(wěn)定的基因是RPL和UBCE2，應(yīng)選用這2 個(gè)基因作為內(nèi)參基因；干旱脅迫下，AP-2和ACT基因是排名第1、2 位的基因，適合作為干旱脅迫下的內(nèi)參基因；熱害脅迫下，MDH和EF-1A是表達(dá)最穩(wěn)定的基因。綜合所有脅迫數(shù)據(jù)看，AP-2和UBCE2基因是排名最靠前的，而H3、EF-1A、PROF和18S基因都是排名較后的，不適合于作為海州常山脅迫的內(nèi)參基因。

表5 ReFinder 軟件綜合分析結(jié)果Table 5 Results of the comprehensive ReFinder software analysis

2.3.5 篩選內(nèi)參基因的鑒定 為了驗(yàn)證所篩選的參考基因，采用qRT-PCR 檢測(cè)了不同非生物脅迫條件下CtNHX1基因表達(dá)（圖3）。CtNHX1基因的表達(dá)使用最穩(wěn)定的參考基因組合進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并與最不穩(wěn)定的參考基因H3進(jìn)行比較。干旱脅迫，CtNHX1的表達(dá)量在0～2 h 和12～24 h 上調(diào)，其他時(shí)間內(nèi)基因表達(dá)量下降。鹽脅迫，CtNHX1在0～48 h 內(nèi)基因表達(dá)量上調(diào)，此后下調(diào)。熱害脅迫，0～2 h，6～12 h，CtNHX1基因表達(dá)量上調(diào)，其余時(shí)間下調(diào)。當(dāng)使用篩選出的穩(wěn)定參考基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，基因表達(dá)水平顯示出相似的趨勢(shì)。然而，使用H3進(jìn)行歸一化會(huì)導(dǎo)致完全不同的結(jié)果，說(shuō)明所篩選的內(nèi)參基因可靠，可作為海州常山非生物脅迫下的內(nèi)參基因使用。

圖3 用CtNHX1 驗(yàn)證在不同脅迫下篩選的內(nèi)參基因穩(wěn)定性Fig.3 The stability of the internal reference genes selected under different stresses was verified by CtNHX1.

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)因靈敏度高、特異性強(qiáng)和可重復(fù)強(qiáng)，已成為檢測(cè)核酸含量和分析基因相對(duì)表達(dá)水平的最重要技術(shù)之一；然而，不同物種所適合的內(nèi)參基因也不同，因此，需要根據(jù)物種選擇適合的內(nèi)參基因。海州常山是一種重要的藥用植物，具有極好的耐鹽性、觀賞性和開(kāi)發(fā)前景，土壤鹽漬化是一個(gè)世界性的問(wèn)題，選擇合適的沿海鹽堿植物一直是恢復(fù)沿海生態(tài)的焦點(diǎn)[12]，篩選海州常山內(nèi)參基因幫助我們?cè)诜肿铀缴细玫乩斫庵参锏哪望}性及更好地開(kāi)發(fā)利用植物的耐鹽性。

由于不同計(jì)算軟件的統(tǒng)計(jì)算法和分析程序?qū)е禄蚍€(wěn)定性排名有所差異，不同的軟件給出了不同的結(jié)果，這是由于不同軟件篩選穩(wěn)定性考慮的算法側(cè)重點(diǎn)不同造成的。總體來(lái)說(shuō)雖有差異，但基因的穩(wěn)定排名大致相同，以鹽脅迫下的內(nèi)參基因篩選為例，GeNorm 和NormFinder 軟件分析RPL、UBCE2基因表達(dá)穩(wěn)定，BestKeeper 軟件卻認(rèn)為ACT基因表達(dá)最穩(wěn)定，UBCE2基因穩(wěn)定性排第二；ReFinder軟件綜合分析得出，RPL、UBCE2和AP-2基因是鹽脅迫下穩(wěn)定性排名前三基因。從分析結(jié)果看，各個(gè)分析軟件的結(jié)果雖有不同，但僅僅是排名名次上有些差異，差異性不大且穩(wěn)定性值相差也不大。

ACT和AP-2在干旱脅迫下最穩(wěn)定表達(dá)，ACT在何首烏、紅麻等多個(gè)物種中被證實(shí)穩(wěn)定表達(dá)[13-14]，在葡萄非生物脅迫下，基因AP-2也被鑒定為合適的參考基因[15]。熱害脅迫下MDH和EF-1A是表達(dá)最穩(wěn)定的基因，在樟樹(shù)、黃秋葵中EF-1A被證明是最適合熱應(yīng)激的參考基因[16-17]。已經(jīng)證實(shí)UBCE2和RPL基因在很多植物的非生物脅迫下是穩(wěn)定表達(dá)的[18-20]，這與海州常山葉片鹽害脅迫下的結(jié)果相吻合。綜合所有脅迫數(shù)據(jù)看，AP-2和UBCE2基因是排名最靠前的，這和在福建柏中的結(jié)果相似[21]。在本研究中，H3是最不穩(wěn)定的參考基因之一，在海州常山葉片中不適合作為內(nèi)參基因使用。

為了驗(yàn)證選擇的參考基因的可靠性，通過(guò)利用篩選出的內(nèi)參基因?qū)tNHX1表達(dá)水平進(jìn)行歸一化。當(dāng)使用CtNHX1基因來(lái)鑒定所篩選內(nèi)參基因的表達(dá)量時(shí)，CtNHX1基因在鹽害處理下48 h 時(shí)基因表達(dá)量最高，這和在短角海蓬子SbNHX1進(jìn)行高鹽脅迫下的基因表達(dá)量相似[22]；在干旱脅迫處理后2 h 時(shí)基因表達(dá)量上調(diào)而后下降，在24 h 時(shí)基因表達(dá)量達(dá)到最高，而后又顯現(xiàn)下降趨勢(shì)[23]，這與海馬齒SpNHX1基因表達(dá)量具有相似的規(guī)律?？傮w結(jié)果顯示，使用本研究篩選出的內(nèi)參基因及內(nèi)參基因組合進(jìn)行基因表達(dá)水平歸一化時(shí)，目的基因表達(dá)量具有相似的表達(dá)規(guī)律，在各種非生物脅迫處理中表達(dá)是穩(wěn)定的，而用不穩(wěn)定的H3基因進(jìn)行目的基因表達(dá)水平檢測(cè)時(shí)，結(jié)果顯示目的基因表達(dá)水平與本研究用篩選出的內(nèi)參基因檢測(cè)的目的基因表達(dá)水平規(guī)律明顯不同，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

4 結(jié)論

通過(guò)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性和有效性評(píng)估與分析，發(fā)現(xiàn)AP-2、UBCE2在海州常山葉片非生物脅迫下穩(wěn)定表達(dá)，下一步將繼續(xù)利用海州常山轉(zhuǎn)錄組學(xué)，挖掘海州常山脅迫條件下優(yōu)良的抗逆基因，研究相關(guān)基因的表達(dá)模式。這項(xiàng)工作為今后海州常山分子機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)，也為其他馬鞭草物種分子水平的探究提供了內(nèi)參基因選擇的參考。