血清IL-17及其基因-197A/G位點(diǎn)基因多態(tài)性與酒精性肝病易感性的關(guān)系

蓋楠

【摘要】 目的：分析血清白介素-17（interleukin-17，IL-17）及其基因-197A/G位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與酒精性肝病易感性的關(guān)系。方法：選擇于2019年3月-2020年3月在朝陽市第四醫(yī)院治療的120例酒精性肝病患者為研究對象。根據(jù)疾病情況將患者分為脂肪肝組（n=37），肝硬化組（n=52）及肝癌組（n=31）。另選取同期在本院體檢的60例健康成年人為對照組。利用ELISA法檢測四組的血清IL-17水平，利用DNA提取試劑盒提取血清總DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-連接酶檢測反應(yīng)（polymerase chain reaction-ligase detection reaction，PCR-LDR）檢驗(yàn)IL-17的197A/G基因多態(tài)性。對比四組的血清IL-17水平、基因型差異;分析酒精性肝病與血清IL-17、197A/G基因型相關(guān)性。結(jié)果：四組血清IL-17水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;肝癌組、肝硬化組、脂肪肝組IL-17水平均高于對照組，肝癌組高于肝硬化組、脂肪肝組，肝硬化組高于脂肪肝組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。IL-17 197A/G位點(diǎn)基因型分為三種，分別為AA、AG、GG。肝硬化組和肝癌組AA、AG基因型的分布比例均高于脂肪肝組和對照組，而肝硬化組和肝癌組GG基因型的分布比例均低于脂肪肝組和對照組（P<0.05）。肝硬化組和肝癌組中均等位基因A頻率高于脂肪肝組和對照組，而等位基因G頻率均低于脂肪肝組和對照組（P<0.05）。Spearman相關(guān)性分析顯示，酒精性肝病與血清IL-17水平呈正相關(guān)（r=0.734，P<0.05），與197A/G位點(diǎn)基因型呈負(fù)相關(guān)（r=-0.682，P<0.05）。結(jié)論：IL-17水平和酒精性肝病進(jìn)展呈一定的相關(guān)性，且A等位基因和AA基因型在IL-17 197A/G位點(diǎn)位置是酒精性肝病發(fā)生惡化的易感基因，臨床可根據(jù)該位點(diǎn)的基因型預(yù)防酒精性肝病進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】 白介素-17 197A/G位點(diǎn) 單核苷酸多態(tài)性 酒精性肝病 易感性

Relationship between Serum IL-17 Level and Its Gene-197A/G Locus Gene Polymorphism and Susceptibility to Alcoholic Liver Disease/GAI Nan. //Medical Innovation of China， 2022， 19（01）： -136

[Abstract] Objective： To explore the relationship between serum IL-17 level and its gene-197A/G single nucleotide polymorphism and susceptibility to alcoholic liver disease. Method： A total of 120 patients with alcoholic liver disease who were treated in Chaoyang Fourth Hospital from March 2019 to March 2020 were selected as the research objects. They were divided into fatty liver group （n=37）， cirrhosis group （n=52） and liver cancer group （n=31） according to disease conditions. Another 60 healthy adults in our hospital were selected as the control group. The serum IL-17 levels of the four groups were detected by ELISA， the total DNA was extracted by DNA extraction kit， and gene-197A/G single nucleotide polymorphism was detected by polymerase chain reaction-ligase detection reaction （PCR-LDR）. The serum IL-17 levels and genotypes of the four groups were compared. The correlation between alcoholic liver disease and serum IL-17， 197A/G genotype was analyzed. Result： There was statistical significance in serum IL-17 level among the four groups （P<0.05）. The IL-17 levels of liver cancer group， liver cirrhosis group and fatty liver group were higher than that of control group， liver cancer group was higher than those of liver cirrhosis group， fatty liver group， liver cirrhosis group was higher than that of fatty liver group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The genotypes of IL-17 197A/G locus were divided into AA， AG and GG， respectively. The distribution proportions of AA and AG genotypes in liver cirrhosis group and liver cancer group were higher than those in fatty liver group and control group， while the distribution proportions of GG genotypes in liver cirrhosis group and liver cancer group were lower than those in fatty liver group and control group （P<0.05）. The frequency of allele A in liver cirrhosis group and liver cancer group were higher than those in fatty liver group and control group， while the frequency of allele G were lower than those in fatty liver group and control group （P<0.05）. Spearman correlation analysis showed that alcoholic liver disease was positively correlated with serum IL-17 level （rs=0.734， P<0.05）， and negatively correlated with 197A/G locus genotype （rs=-0.682， P<0.05）. Conclusion： IL-17 level is correlated with the progression of alcoholic liver disease to a certain extent， and A allele and AA genotype at 197A/G site of IL-17 are susceptibility genes for the progression of alcoholic liver disease， which can be clinically prevented according to the genotype at this site.

[Key words] IL-17 197A/G locus Single nucleotide polymorphism Alcoholic liver disease Susceptibility

First-author’s address： Chaoyang Fourth Hospital， Liaoning Province， Chaoyang 122000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.01.033

酒精性肝病作為一種長時(shí)間過量飲酒引起的肝臟損傷性疾病，和正常人群相比，長期過量飲酒者的病死率超過正常人群的2倍左右，其中神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟相關(guān)疾病的發(fā)病率較正常人群至少高2成[1]。目前，臨床研究發(fā)現(xiàn)酒精性肝病的發(fā)病過程需要經(jīng)過三個(gè)階段，其中僅酒精性脂肪肝是可通過治療逆轉(zhuǎn)病理學(xué)改變，讓患者恢復(fù)健康;酒精性肝硬化則無法通過治療來逆轉(zhuǎn)肝臟的病理學(xué)改變，預(yù)后不良;接近15%酒精性肝硬化患者隨著病情的發(fā)展會轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞癌[2-4]。因此，早期診斷并治療酒精性肝病對于患者恢復(fù)健康，防止肝硬化，甚至肝癌的產(chǎn)生意義重大。據(jù)報(bào)道，通過對小鼠肝癌模型研究發(fā)現(xiàn)，敲除IL-17A基因和IL-17A信號通路的藥物阻斷可明顯將酒精誘導(dǎo)的小鼠肝癌生長進(jìn)行抑制，說明IL-17信號通路可以作為治療酒精性肝癌新靶點(diǎn)[5]。此外，IL-17水平及其基因位點(diǎn)的多態(tài)性和酒精性肝病之間存在一定的相關(guān)性，且不同區(qū)域、不同人群的IL-17單核苷酸多態(tài)性存在差異[6]。本研究通過分析分析血清IL-17水平及其基因-197A/G位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與酒精性肝病易感性的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月-2020年3月在遼寧省朝陽市第四醫(yī)院治療的120酒精性肝病患者為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合文獻(xiàn)[7]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，至少五年不間斷的過量飲酒（男性乙醇飲用量至少40 g/d、女性至少20 g/d）或2周內(nèi)乙醇飲用量超過80 g/d;（2）無明顯臨床癥狀或出現(xiàn)乏力、右上腹的脹痛、體質(zhì)量下降、食欲不振等，伴隨著病情的發(fā)展，有肝掌、蜘蛛痣和精神異常等表現(xiàn);（3）血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高;（4）表現(xiàn)出彌漫性脂肪肝診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）肝臟病變已經(jīng)處于終末期，實(shí)施肝移植手術(shù);（2）合并乙肝等病毒性感染;（3）伴有藥物性肝病;（4）伴有惡性腫瘤;（5）合并嚴(yán)重的臟器損傷;（6）合并全胃腸外營養(yǎng)等引發(fā)脂肪肝的疾病。其中男99例，女21例;年齡28～78歲，平均（49.3±10.5）歲。根據(jù)疾病情況將患者分為脂肪肝組（n=37），肝硬化組（n=52）及肝癌組（n=31）。另選取同期在遼寧省朝陽市第四醫(yī)院體檢的60例健康成年人為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：長期過量飲酒;肝功能各項(xiàng)指標(biāo)均正常;肝臟影像學(xué)檢查并未出現(xiàn)任何異常;排除標(biāo)準(zhǔn)：存在酒精性肝病家族史。所有納入對象均知情同意，本研究經(jīng)遼寧省朝陽市第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 血清IL-17檢測 于清晨抽取空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上層血清。采用ELISA法檢測，試劑盒均來自南京基蛋生物科技有限公司，檢測設(shè)備為美國THERMO Varioskan Flash 4.00.52多功能酶標(biāo)儀;設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，依次加樣本和抗體，37 ℃孵育1 h，去除上層液體，重復(fù)洗滌3次，最后加入底物，37 ℃避光反應(yīng)15 min。490 nm處利用酶標(biāo)儀檢測其吸收值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線算出IL-17的相對表達(dá)量。

1.3 IL-17 197A/G單核苷酸多態(tài)性檢測 利用DNA提取試劑盒（購自天根生化科技有限公司）提取血清總DNA，然后利用PCR-LDR（連接酶檢測反應(yīng)）檢驗(yàn)IL-17 197A/G單核苷酸基因多態(tài)性，擴(kuò)增引物：上游引物為5’-AACAAGTAAGAATGAAAAGAGGACATGGT-3’，下游引物為5’-CCCCCAATGAGGTCATAGAAGAATC-3’，延伸引物為TACCCTTGCTAAGGCTTCTTGCCGA。具體操作如下：引物和探針由上海百研生物科技公司完成合成，將DNA樣本稀釋至10 ng/μL后加1 μL至反應(yīng)體系（包含引物混合物1 μL，Master mix 5μL和3 μL ddHO）。置入PCR儀，94 ℃下2 min變性后，進(jìn)行11個(gè)94 ℃（20 s）-65 ℃（40 s）-72 ℃（60 s）的循環(huán)，在進(jìn)入94 ℃（20 s）-59 ℃（30 s）-72 ℃（90 s）的24個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 120 s。隨后加入1 μL Exol/SAP酶，37 ℃下恒溫1 h后滅活。使用試劑盒進(jìn)行雙鏈接反應(yīng)，將稀釋后的連接產(chǎn)物送上海生工生物公司測序，使用DNAman 9.0分析數(shù)據(jù);并分析酒精性肝病與血清IL-17、197A/G位點(diǎn)基因型相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ檢驗(yàn);相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組一般資料比較 脂肪肝組男30例，女7例;年齡30～78歲，平均（50.3±10.2）歲。肝硬化組男43例，女9例;年齡29～76歲，平均（49.8±10.3）歲。肝癌組男26例，女5例;年齡30～77歲，平均（50.1±10.0）歲。對照組男41例，女19例;年齡31～73歲，平均（50.5±10.3）歲。四組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 四組IL-17水平比較 肝癌組IL-17水平為（37.48±5.14）ng/L;肝硬化組IL-17水平為（29.45±5.04）ng/L;脂肪肝組IL-17水平為（22.05±3.85）ng/L;對照組IL-17水平為（15.38±3.04）ng/L，四組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.681，P=0.000）;肝癌組、肝硬化組、脂肪肝組IL-17水平均高于對照組（q=25.770、18.154、9.469，P=0.000），肝癌組高于肝硬化組、脂肪肝組（q=6.970、14.137，P=0.000），肝硬化組高于脂肪肝組（q=4.723，P=0.000）。

2.3 四組IL-17 197A/G位點(diǎn)基因型分布 IL-17 197A/G位點(diǎn)基因型分為三種，分別為AA、AG、GG。四組IL-17 197A/G位點(diǎn)基因型分布比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ=30.217，P=0.000）。肝硬化組和肝癌組AA、AG基因型的分布比例均高于脂肪肝組和對照組，而肝硬化組和肝癌組GG基因型的分布比例均低于脂肪肝組和對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.4 四組IL-17 197A/G位點(diǎn)基因頻率分布 四組IL-17 197A/G位點(diǎn)基因頻率分布比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ=45.218，P=0.000）。肝硬化組和肝癌組中均等位基因A頻率高于脂肪肝組和對照組，而等位基因G頻率均低于脂肪肝組和對照組（P<0.05）。見表2。

2.5 IL-17 197A/G位點(diǎn)基因型與酒精性肝病的相關(guān)性分析 定義：健康人群=1，脂肪肝=2，肝硬化=3，肝癌=4，酒精性肝病與血清IL-17水平呈正相關(guān)（r=0.734，P<0.05）。定義：AA=1，AG=2，GG=3，酒精性肝病與197A/G位點(diǎn)基因型呈負(fù)相關(guān)（r=-0.682，P<0.05）。

3 討論

酒精性肝病是長時(shí)間攝入大量乙醇造成的一種慢性肝臟疾病。我國作為酒文化大國，酒桌文化盛行，酒精肝逐漸成為肝硬化、肝癌主要誘因。目前，臨床上關(guān)于酒精性肝病發(fā)病機(jī)制研究較多，其中酒精性脂肪肝發(fā)展到肝硬化的本質(zhì)是肝臟持續(xù)性損傷造成肝細(xì)胞修復(fù)期間不斷地壞死、再生，導(dǎo)致增生的間質(zhì)纖維結(jié)締組織讓肝臟結(jié)構(gòu)、功能改變，這期間乙醇等會通過氧化應(yīng)激、毒性作用、免疫介導(dǎo)、脂質(zhì)過氧化以及細(xì)胞凋亡等方式加速肝臟細(xì)胞損傷[8-10]。IL-17是由Th17細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種炎性因子，其可刺激內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞產(chǎn)生其他炎性因子和趨化因子等，引起組織損傷[11]。Akbulut等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Th17通路在酒精性肝病中的發(fā)展中具有重要作用，肝細(xì)胞損傷程度和IL-17的水平呈正相關(guān)，且酒精中毒和酒精性肝硬化患者的IL-17水平較正常人明顯升高。

本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組IL-17水平均高于其他三組，肝硬化組高于脂肪肝組和對照組，脂肪肝組高于對照組（P<0.05）。說明IL-17異常升高在酒精肝病情進(jìn)展中起到重要作用。其原因可能是長期大量的攝入乙醇導(dǎo)致IL-17水平上升，刺激肝星狀細(xì)胞分泌TNF-α、TGF-β等細(xì)胞因子，激活細(xì)胞凋亡蛋白酶，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，加速疾病的進(jìn)展[13-16]。本研究通過分析不同階段酒精性肝病患者IL-17 197A/G位點(diǎn)基因多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝硬化組和肝癌組AA、AG基因型比例和等位基因A的頻率均高于脂肪肝組、對照組，而肝硬化組和肝癌組GG基因型比例和等位基因G的頻率均低于脂肪肝組、對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明了人群中酒精性肝病發(fā)展的遺傳背景存在一定的差異，AA基因型和A等位基因患者更容易發(fā)生酒精肝，且在不可逆性的酒精性肝損傷中發(fā)揮重要作用[17-19]。李瑩等[20]研究亦發(fā)現(xiàn)197A/G位點(diǎn)AA基因型會增加病毒性肝炎的風(fēng)險(xiǎn)，但是對于攜帶該基因型的患者酒精肝進(jìn)展機(jī)制目前還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，IL-17水平和酒精性肝病進(jìn)展呈一定的相關(guān)性，且IL-17 197A/G位點(diǎn)的AA基因型和A等位基因頻率更高的患者容易出現(xiàn)酒精肝，臨床可根據(jù)該位點(diǎn)的基因型預(yù)防酒精性肝病的發(fā)生、發(fā)展。然而，本研究由于樣本量和樣本來源的限制，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本及樣本范圍，進(jìn)一步分析酒精性肝病易感基因，并分析其可能的機(jī)制。

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（收稿日期：2021-05-17） （本文編輯：田婧）