澳洲堅(jiān)果不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)與不定芽增殖研究

羅一然 沈德周 縱丹 尹加筆 何承忠

摘? 要：以澳洲堅(jiān)果品種‘H2’的幼嫩莖段和種子為材料，獲取腋芽、子葉和上胚軸等外植體，開展愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽增殖研究，再通過石蠟切片法對(duì)不同愈傷組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，分析比較不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織性質(zhì)與不定芽分化效果。結(jié)果表明：適合腋芽愈傷誘導(dǎo)和分化的培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT，腋芽愈傷量大，不定芽增殖系數(shù)為3.49;適合子葉愈傷誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L TDZ+200 mg/L CH，愈傷組織多為綠色且質(zhì)地緊密，誘導(dǎo)率高達(dá)82.2%，褐化率低至8.9%;適合子葉愈傷組織分化不定芽的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L KT+0.2 mg/L NAA+ 1.0?mg/L GA，不定芽長勢較好，增殖系數(shù)為5.40;上胚軸幾乎不產(chǎn)生愈傷組織，可直接分化不定芽;適合上胚軸分化不定芽的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA，增殖系數(shù)為7.37。細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，腋芽愈傷組織的細(xì)胞體積較大、液泡化程度較高、細(xì)胞質(zhì)較少、細(xì)胞核較小，且細(xì)胞間排列分散且不規(guī)則，顯示出非胚性愈傷組織特征;子葉愈傷細(xì)胞排列較緊密、細(xì)胞核較大、細(xì)胞質(zhì)較厚且被染色深，顯示出分生組織細(xì)胞的特征。比較而言，子葉是誘導(dǎo)愈傷組織的優(yōu)良材料，上胚軸是不定芽增殖的最佳外植體。

關(guān)鍵詞：澳洲堅(jiān)果;外植體;愈傷組織;不定芽;增殖中圖分類號(hào)：S664.9 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Callus Induction and Adventitious Bud Proliferation in Different Explants of

LUO Yiran， SHEN Dezhou， ZONG Dan， YIN Jiabi， HE Chengzhong

1. Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province， Southwest Forestry University， Kunming， Yunnan 650233， China; 2. Dali Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry， Dali， Yunnan 671003， China; 3. Dehong Forestry and Grassland Bureau， Dehong， Yunnan 678400， China

The axillary buds， cotyledons and epicotyls which were obtained from young stem segments and seeds of ‘H2’ were used as the explants， the callus induction and adventitious bud proliferation， and then cytological observations of the different callus by paraffin slice were conducted to analyze and compare the callus properties and adventitious bud differentiation effects induced by different explants. The suitable medium for axillary buds was MS+2.0?mg/L 6-BA+0.5?mg/L KT， which had the large numbers of callus and the adventitious bud regeneration coefficient was 3.49. The suitable medium for cotyledon callus induction was MS+2.0 mg/L TDZ+ 200?mg/L CH， the callus in this medium were green and tight， the induction rate was 82.2%， the browning rate was 8.9%， the cooperation of CH and TDZ not only helpt to improve the induction rate of cotyledon callus， but also reduced the browning rate. The optimal medium for adventitious buds of cotyledon callus differentiation was MS+1.0?mg/L KT+0.2?mg/L NAA+1.0 mg/L GA， the adventitious buds grew well and the regeneration coefficient was 5.40. The suitable medium for epicotyls adventitious bud differentiation was MS+1.0 mg/L KT+0.5?mg/L NAA， and the regeneration coefficient was 7.37. The adventitious bud differentiation ability of the three explants from high to low was epicotyl>cotyledon>axillary bud， and KT combined with other suitable concentrations of growth regulators could produce better adventitious bud differentiation effect， which is the key to promote adventitious bud differentiation. The cotyledons and axillary buds dedifferentiated into callus， and then redifferentiated into adventitious buds， but the epicotyls could directly differentiate adventitious buds without producing callus. The callus induced by axillary bud and cotyledon showed obvious differences in appearance and cytology. A relevant cytological observation showed that the axillary bud callus had large cell volume， high degree of vacuolation， little cytoplasm， and small nucleus， with scattered and irregular intercellular distribution， showing the characteristics of non-embryonic callus， while the cotyledon callus had compact cell arrangement， large nucleus， and deeply stained thick cytoplasm， showing the characteristics of meristematic cell. In comparison， cotyledon is an good material for callus induction， and epicotyl is the best explants for adventitious bud proliferation， the cotyledon callus have some characteristics of embryogenic callus and high differentiation capability， it can be used as a test material for genetic transformation and polyploid induction of macadamia.

; explants; callus; adventitious bud; proliferation

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.012

澳洲堅(jiān)果（ F. Mull）又叫澳洲胡桃、夏威夷果、昆士蘭堅(jiān)果，是一種原產(chǎn)于澳大利亞的常綠喬木果樹。澳洲堅(jiān)果的果仁油分含量高達(dá)70%～80%，且含有大量不飽和脂肪酸，被認(rèn)為是世界上最美味的干果之一，在國際市場上供不應(yīng)求，擁有非常良好的市場前景。近年來，澳洲堅(jiān)果在云南省的發(fā)展備受重視，已成為繼核桃之后深受群眾歡迎的特色經(jīng)濟(jì)林樹種。截至2020年底，云南全省種植面積已超266?000 hm，成為中國乃至全球最大的澳洲堅(jiān)果種植基地。

澳洲堅(jiān)果苗木繁育主要采用嫁接繁殖，但嫁接法費(fèi)時(shí)費(fèi)工，且易受母株繁殖材料數(shù)量與質(zhì)量以及不良?xì)夂颦h(huán)境的限制，難以實(shí)現(xiàn)良種苗木規(guī)?；a(chǎn)。植物組織培養(yǎng)育苗技術(shù)既能保持母株優(yōu)良特性，又可以擺脫氣候環(huán)境變化的不利影響，便于良種繁殖生長和周年生產(chǎn)，已成為一些園藝作物工廠化育苗的主要方式。關(guān)于澳洲堅(jiān)果組織培養(yǎng)的研究已有不少報(bào)道，MULWA和BHALLA等探討了不同濃度的BA和GA對(duì)澳洲堅(jiān)果組培苗增殖和長勢的影響，并進(jìn)一步優(yōu)化了組培體系。GITONGA等研究了不同基本培養(yǎng)條件下，澳洲堅(jiān)果組培苗的生長情況，發(fā)現(xiàn)在WPM培養(yǎng)基上幼嫩莖段的萌芽率最高，但生根培養(yǎng)沒有成功。CHAUM等選用蛭石代替MS培養(yǎng)基中的瓊脂，并補(bǔ)充高濃度CO，使澳洲堅(jiān)果組培苗誘導(dǎo)出了發(fā)達(dá)的根系。郭凌飛等以澳洲堅(jiān)果莖段為外植體進(jìn)行試驗(yàn)，獲得了萌芽率較高的培養(yǎng)基配方，但未能成功獲得生根苗。肖再云通過莖段培養(yǎng)的愈傷組織和畸胚分化出不定芽，利用單芽誘根60 d后再于沙床中煉苗60 d，最終獲得生根苗。荷蘭秀選用適當(dāng)?shù)募t外照射和LED光源照射，提高了澳洲堅(jiān)果外植體的萌芽率。然而，目前澳洲堅(jiān)果組培技術(shù)尚不成熟，存在外植體取材單一、培養(yǎng)周期長和增殖系數(shù)低等問題，限制了澳洲堅(jiān)果良種快繁工作的開展。

愈傷組織是不定芽增殖、多倍體誘導(dǎo)、細(xì)胞培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化等研究的常用材料。為了建立高效的增殖體系，獲得可供遺傳轉(zhuǎn)化研究的愈傷組織，需要比較不同類型外植體的培養(yǎng)效果。一般而言，莖段和葉片因取材、預(yù)處理、滅菌及培養(yǎng)等環(huán)節(jié)操作簡易而成為普遍采用的外植體。對(duì)于許多木本植物，培養(yǎng)胚、胚乳、子葉、胚軸是誘導(dǎo)胚性愈傷組織的有效材料，可以建立穩(wěn)定性好、誘導(dǎo)系數(shù)高的快繁體系，但在澳洲堅(jiān)果上尚無相關(guān)報(bào)道。因此，建立澳洲堅(jiān)果愈傷誘導(dǎo)和再生技術(shù)，對(duì)其苗木快繁、種質(zhì)保存利用、遺傳改良等方面有重要意義。本研究擬以澳洲堅(jiān)果的腋芽、子葉及上胚軸為外植體，通過篩選不同的生長調(diào)節(jié)劑配比和培養(yǎng)條件，比較研究不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化能力的差異，明確適宜誘導(dǎo)愈傷組織及分化不定芽的培養(yǎng)條件，為澳洲堅(jiān)果組培育苗技術(shù)研究提供參考，并為澳洲堅(jiān)果基因工程研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

材料

從德宏州林業(yè)和草原局苗圃中心引進(jìn)由澳洲堅(jiān)果品種‘H2’的種子繁殖而來的2年生實(shí)生苗，并將該實(shí)生苗栽種于西南林業(yè)大學(xué)（云南昆明）的溫室大棚內(nèi)，待其生長正常后，于3—7月間采集其剛抽梢長4～5 cm的幼嫩帶芽莖段為外植體。種子材料取自苗圃中心處于盛果期（6—7月）的‘H2’實(shí)生樹，采集其未脫落、飽滿且無病蟲害的果實(shí)，去除果皮后保存在4℃冰箱中備用。

?方法

1.2.1? 澳洲堅(jiān)果莖段培養(yǎng)? 將采集的幼嫩莖段剪去葉片，仔細(xì)清洗后將其置于燒杯中進(jìn)行流水沖洗1 h，再經(jīng)75%乙醇浸泡20 s、無菌水沖洗4次、5%次氯酸鈉浸泡3 min、0.1%升汞處理5 min、無菌水沖洗4～6次后，在超凈工作臺(tái)上截取2 cm左右的莖段，接種至WPM+ 2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA+200 mg/L AC的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15 d，獲得健壯的腋芽。

1.2.2 ?澳洲堅(jiān)果種子滅菌以及子葉、上胚軸獲取 ?將種子放入滅菌蒸餾水中浸泡24?h，取出并用濾紙吸干種子表面的水分，再置于75%乙醇中浸泡10?s后，在超凈工作臺(tái)上利用堅(jiān)果鉗打開種殼，取出種仁且放入0.1%升汞中滅菌2?min，用手術(shù)刀將種仁平均切成2部分，即含胚芽部分和純子葉部分（圖1A）。上胚軸獲取（圖1B）：將含胚芽部分的種仁接種在MS空白培養(yǎng)基上，待萌發(fā)后獲得上胚軸。子葉獲?。河檬中g(shù)刀將含純子葉部分的種仁切成長×寬×高=3 mm×4 mm×2 mm的方塊。

1.2.3? 愈傷組織誘導(dǎo)與不定芽分化? （1）腋芽愈傷組織誘導(dǎo)與不定芽分化。待莖段外植體的腋芽長至1～2 cm時(shí)，將其切下插入分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽。培養(yǎng)條件如表1所示，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的噻苯隆（TDZ）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和激動(dòng)素（KT）。每個(gè)處理接5瓶，每瓶接入3個(gè)單芽，重復(fù)3次。于45 d后統(tǒng)計(jì)不定芽增殖系數(shù)（不定芽增殖系數(shù)=不定芽個(gè)數(shù)/接種的腋芽數(shù)）。

（2）子葉愈傷組織誘導(dǎo)。將含子葉部分的種仁接入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)15 d后轉(zhuǎn)入光照環(huán)境，記錄愈傷誘導(dǎo)情況，并注意移除褐化材料。培養(yǎng)條件如表2所示，以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的TDZ、6-BA和水解酪蛋白（CH）。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接入3片子葉，重復(fù)3次。于45 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率和褐化率。誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷的子葉個(gè)數(shù)/接種的子葉數(shù)×100%，褐化率=褐化的子葉個(gè)數(shù)/接種的子葉數(shù)×100%。

1.2.4 ?子葉愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽 ?將子葉愈傷組織取出，剪去褐化和壞死部分，切成1?cm× 1?cm的方塊，接入不定芽分化培養(yǎng)基，觀察記錄叢生芽的生長情況。培養(yǎng)方案：以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)L（3）的正交實(shí)驗(yàn)，因素水平為：KT（1.0、2.0、3.0 mg/L）、NAA（0.2、0.5、1.0 mg/L）、赤霉素（GA3，0.2、0.5、1.0 mg/L）。每個(gè)處理接5瓶，每瓶接入3個(gè)愈傷組織，重復(fù)3次，于30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化系數(shù)（不定芽分化系數(shù)=不定芽個(gè)數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)）。

1.2.5 ?上胚軸愈傷組織誘導(dǎo)與不定芽分化? 胚芽部分在培養(yǎng)基上萌發(fā)后，待上胚軸伸長至4～5 cm時(shí)，將上胚軸平均剪成胚軸和頂芽兩部分，頂芽部分接種到腋芽愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖分化，胚軸部分接入分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。培養(yǎng)條件：以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA（1.0 mg/L）、KT（1.0 mg/L）、NAA（0.5 mg/L）、GA（0.5 mg/L）和吲哚丁酸（IBA，0.5 mg/L）。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種2個(gè)外植體，重復(fù)3次。于30?d統(tǒng)計(jì)不定芽分化系數(shù)（不定芽分化系數(shù)=不定芽個(gè)數(shù)/接種的上胚軸數(shù)）。

1.2.6 ?愈傷組織細(xì)胞學(xué)觀測方法? 將腋芽和子葉誘導(dǎo)得到的愈傷組織制成石蠟切片，分別對(duì)其表面結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察。試驗(yàn)采用常規(guī)石蠟切片法，過程包括取材、滅活、固定、保存、脫水、浸蠟、包埋、切片、粘片、染色、封片，最后在顯微鏡下的對(duì)切片觀察拍照。

?數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)整理后，采用SPSS 17.0、Excel 2007等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。

結(jié)果與分析

植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)腋芽愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，腋芽愈傷組織在接種15?d左右從腋芽基部的切口處開始產(chǎn)生，愈傷質(zhì)地緊密，為乳白色海綿狀（圖2A）;再培養(yǎng)30?d左右，愈傷組織則分化出不定芽（圖2B）。植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)腋芽增殖的結(jié)果如表3所示，不同處理間的增殖系數(shù)差異較大，以處理7和處理3的增殖系數(shù)較大，分別為3.49和3.09，但二者差異不顯著;其次是處理8（2.91）、處理4（2.67）和處理1（2.56），三者之間未達(dá)到顯著差異水平，但三者均顯著低于處理7，而與處理3差異不明顯;處理5的增殖系數(shù)最低，僅為1.27。所有處理均能誘導(dǎo)出愈傷組織，處理1、4、7所誘導(dǎo)的愈傷量較多，其次是處理2、3、8，處理5最少。本研究發(fā)現(xiàn)，TDZ或6-BA與高濃度的NAA（1.0?mg/L）組合易造成芽的玻璃化，而二者與低濃度的NAA（0.5?mg/L）組合則使得不定芽長勢良好;在處理5～8中，KT與TDZ組合導(dǎo)致腋芽愈傷誘導(dǎo)量及不定芽增殖效果較差，而KT與6-BA組合對(duì)腋芽增殖效果較好。

?植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)子葉愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響

2.2.1 ?愈傷組織誘導(dǎo)? 將含子葉部分的果仁在培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)15 d左右，可觀察到子葉由乳白色轉(zhuǎn)變成淡黃色（圖3B），之后轉(zhuǎn)入2000 Lx光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，15 d后分化出不同形態(tài)的愈傷組織（圖3C、圖3D）。

由表4可知，處理9、11和12誘導(dǎo)出的愈傷組織都呈白色，且為松散狀;處理1、2、4和8誘導(dǎo)出的愈傷組織主要呈綠色，且質(zhì)地緊密;處理3、5、6、7與10等5個(gè)處理誘導(dǎo)的愈傷組織大多質(zhì)地松散，顏色為黃綠色。愈傷組織誘導(dǎo)率在不同處理間存在較大差異，其中，處理3和處理2的誘導(dǎo)率較高，分別為86.7%和82.2%，但二者差異不顯著;其次是處理9，誘導(dǎo)率為75.6%;誘導(dǎo)率最低的是處理10，僅為31.1%。隨著TDZ或6-BA濃度的升高，處理1～3、4～6以及7～9間的愈傷誘導(dǎo)率分別顯著升高，但處理10～12間的差異不顯著。相同濃度下，添加TDZ的培養(yǎng)基所產(chǎn)生的愈傷誘導(dǎo)率（處理1～3和7～9）要高于6-BA（處理4～6和10～12）（表2、表4）。

愈傷組織在培養(yǎng)過程中普遍伴隨著褐化現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，植物生長調(diào)節(jié)劑的選擇和其濃度水平對(duì)子葉愈傷褐化產(chǎn)生較大影響。由表2和表4可知，不同處理間的褐化率差異較大，以處理11的褐化率最高，達(dá)68.9%;其次是處理7～10和12等5個(gè)處理，褐化率為55.6%～66.7%，且處理間差異不顯著;處理2的褐化率最低，僅為8.9%。添加TDZ時(shí)，處理1～3的褐化率以處理2最小，顯著低于處理1和3;處理7～9的褐化率隨TDZ濃度的增加而下降，但三者間差異不明顯。添加6-BA時(shí)，處理4～6的褐化率隨濃度的增加而顯著升高，而處理10～12間的褐化率差異不明顯。同時(shí)，未添加CH的處理（處理7～12）嚴(yán)重發(fā)生褐化現(xiàn)象，其褐化率顯著高于添加了CH的處理（處理1～6）。

2.2.2 ?不定芽分化? 將子葉的愈傷組織接種到不定芽分化培養(yǎng)基，30 d后陸續(xù)分化出不定芽（圖3E、圖3F）。由表5可知，不定芽的長勢和分化系數(shù)在不同處理間差異較大。其中，處理3的不定芽伸長明顯、葉片舒展，且增殖系數(shù)最高，達(dá)到5.40;其次是處理4和5，不定芽生長正常，

葉片或舒或卷，分化系數(shù)分別為4.47與4.02，但二者差異不明顯;處理9的不定芽分化系數(shù)最低，僅為0.76，且芽弱小、玻璃化。試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著NAA濃度升高，處理1～3間的不定芽分化系數(shù)明顯增加，且芽體生長良好，而處理4～6及處理7～9之間的不定芽分化系數(shù)明顯降低，其中處理4～6的芽體正常，處理7～9的芽體玻璃化嚴(yán)重。

不同因素水平的極差分析結(jié)果顯示（表6），KT對(duì)不定芽分化的影響最大，其分化系數(shù)極差值為2.24，而NAA對(duì)不定芽分化的影響最小，其分化系數(shù)極差值為0.34。方差分析結(jié)果顯示（表7），KT與不定芽分化系數(shù)顯著相關(guān)（<0.05），且F值最高，為5.185;而NAA和GA水平間的分化系數(shù)差異均不顯著（>0.05）。

植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)上胚軸誘導(dǎo)不定芽分化的影響

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，上胚軸幾乎不產(chǎn)生愈傷組織，不定芽大多從上胚軸的基部產(chǎn)生;上胚軸在培養(yǎng)15 d后開始誘導(dǎo)出不定芽（圖4A），接種30 d后不定芽葉片舒展、長勢良好（圖4B）。由表8結(jié)果可知，不同處理間的不定芽分化系數(shù)差異較明顯。與對(duì)照（處理7）相比，處理1～6的不定芽分化系數(shù)均顯著升高。其中，處理4的不定芽分化系數(shù)最高，平均每個(gè)外植體可分化7.37個(gè)不定芽;其次是處理5、1及2，不定芽分化系數(shù)分別為為6.60、6.20、6.13，三者之間差異不明顯;處理3和6的不定芽分化系數(shù)幾乎相當(dāng)，與處理1和2也差異不明顯，但顯著低于處理4和5。

?澳洲堅(jiān)果愈傷組織細(xì)胞學(xué)觀測

觀察石蠟切片發(fā)現(xiàn)，腋芽愈傷組織的細(xì)胞大部分體積較大、液泡化程度較高、細(xì)胞質(zhì)較少、細(xì)胞核較小，且細(xì)胞間排列分散且不規(guī)則（圖5A），顯示出分化活性低的非胚性愈傷組織特征。子葉愈傷組織主要表現(xiàn)為細(xì)胞排列較緊密、細(xì)胞核較大、細(xì)胞質(zhì)較厚且被染色深（圖5B），顯示出分生組織細(xì)胞的特征。

討論

植物不同基因型甚至同一基因型的不同部位，其組織的再生能力也不同。許多學(xué)者在研究木本植物愈傷組織誘導(dǎo)及分化時(shí)，會(huì)比較同種植物不同組織部位的誘導(dǎo)效果來選擇合適的外植

體。本研究發(fā)現(xiàn)澳洲堅(jiān)果不同外植體材料的愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化有明顯差異，子葉和經(jīng)莖段培養(yǎng)而獲得的腋芽均能分化出愈傷組織，但經(jīng)胚芽培養(yǎng)而成的上胚軸幾乎不產(chǎn)生愈傷，且這3個(gè)材料的不定芽分化系數(shù)由高到低依次為上胚軸>子葉>腋芽，說明澳洲堅(jiān)果上胚軸具有較強(qiáng)的不定芽分化能力。另外，上胚軸是直接從其基部分化出不定芽，而子葉和腋芽則是經(jīng)愈傷誘導(dǎo)后分化形成不定芽，說明這3種材料的不定芽分化方式不同，其分化機(jī)制有待于探究。

不同外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織在形態(tài)、質(zhì)地和顏色等方面存在一定差異，且不定芽分化能力也有所不同。本研究發(fā)現(xiàn)，腋芽誘導(dǎo)的愈傷組織為乳白色且細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松，子葉誘導(dǎo)出的愈傷組織多為綠色或黃綠色，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)較緊密，表明腋芽和子葉誘導(dǎo)出的愈傷組織在外觀和細(xì)胞學(xué)上都表現(xiàn)出明顯的差異;同時(shí)，盡管這兩種外植體的愈傷組織都能誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，但子葉愈傷組織的不定芽增殖系數(shù)相對(duì)較大。究其原因，這可能與外植體材料類型有關(guān)，因?yàn)榘闹迗?jiān)果果仁富含鐵、磷、鈣、維生素以及多種氨基酸，這些物質(zhì)為子葉愈傷的誘導(dǎo)分化提供了充足的能源。雖然子葉愈傷組織已具備胚性組織的部分特征及較強(qiáng)的分化能力，可作為研究澳洲堅(jiān)果遺傳轉(zhuǎn)化和多倍體誘導(dǎo)的供試材料，但其是否為胚性愈傷組織還有待于進(jìn)一步確定。

研究結(jié)果表明，TDZ或6-BA與不同濃度的NAA、KT或CH組合影響了不同外植體愈傷組織的形成與分化。對(duì)于腋芽，低濃度的NAA與TDZ或6-BA組合能誘導(dǎo)愈傷形成且分化出長勢良好的不定芽，而KT僅與6-BA組合才能表現(xiàn)出較好的愈傷及分化效果，且KT濃度越低，該組合的效果越好。這暗示了低濃度NAA和KT的促進(jìn)效應(yīng)，也意味著KT與TDZ、6-BA之間的協(xié)同作用不同。對(duì)于子葉愈傷的誘導(dǎo)，TDZ較6-BA效果更好，與AINSLEY等使用TDZ誘導(dǎo)杏仁子葉愈傷組織的結(jié)果相似，其原因可能是子葉需要有效刺激才能促進(jìn)脫分化，而TDZ誘導(dǎo)愈傷組織的速率高于其他植物生長調(diào)節(jié)劑數(shù)十倍。有報(bào)道指出，CH可提高愈傷誘導(dǎo)率，改善愈傷質(zhì)量。本研究中，添加CH（200 mg/L）不但有助于提高愈傷誘導(dǎo)率，還能減少褐化現(xiàn)象的發(fā)生，可與TDZ（2.0?mg/L）協(xié)同誘導(dǎo)出較多的且質(zhì)地較緊密的子葉愈傷組織，這與景寧等在桃兒七成熟種胚愈傷組織誘導(dǎo)的報(bào)道較一致。因此，以MS+ 2.0?mg/L TDZ+200?mg/L CH為培養(yǎng)基，可以較高效地誘導(dǎo)出質(zhì)量較好的子葉愈傷組織。

KT能促進(jìn)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸和葉片氣孔開閉，對(duì)愈傷組織分化不定芽效果尤為明顯。黃娟等在杉木研究中發(fā)現(xiàn)，將杉木的胚、子葉、下胚軸和組培苗莖段所誘導(dǎo)的不同質(zhì)地類型愈傷組織接種到含有KT的培養(yǎng)基中，均獲得較高的增殖率。本研究發(fā)現(xiàn)，腋芽愈傷誘導(dǎo)不定芽分化以MS+2.0?mg/L 6-BA+0.5?mg/L KT的處理效果較好，對(duì)子葉愈傷增殖效果較好的生長調(diào)節(jié)劑組合為MS+1.0?mg/L KT+0.2?mg/L NAA+1.0 mg/L GA，誘導(dǎo)上胚軸分化不定芽系數(shù)較高的培養(yǎng)基為MS+1.0?mg/L KT+0.5?mg/L NAA，說明KT與其他適宜濃度的生長調(diào)節(jié)劑配合使用均能使3種外植體產(chǎn)生較好的不定芽分化效果，但不同生長調(diào)節(jié)劑間的交互作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。值得注意的是，在所測試的不同生長調(diào)節(jié)劑因素水平中，KT與子葉愈傷增殖系數(shù)顯著相關(guān)且對(duì)不定芽分化的影響最大，表明KT在誘導(dǎo)子葉愈傷增殖分化方面發(fā)揮主要作用。另外，GA可以提高種子活力，調(diào)節(jié)種子內(nèi)部激素平衡，對(duì)調(diào)控子葉愈傷分化也起到一定功效。

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