基于網絡藥理學探討健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的作用機制

祁明浩，吳 堅，張 一，陳玉超

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

胃癌是嚴重威脅人類生命健康的重大疑難疾病，在我國胃癌的發(fā)病率位于全部惡性腫瘤的第2位，病死率位于全部惡性腫瘤的第3位[1]。我國尚沒有開展胃癌的篩查工作，胃癌經常到晚期才得到診斷，而晚期胃癌患者的中位生存期僅為7～10個月[2]。手術是治療胃癌最為有效也是目前為止唯一有可能治愈的手段，而晚期胃癌無法實施根治手術，多采用化療、分子靶向治療、對癥支持、中醫(yī)中藥等姑息療法。江蘇省中醫(yī)院2009年成為首批國家中醫(yī)臨床研究基地，在國內牽頭開展了胃癌中醫(yī)藥治療的循證醫(yī)學研究。在晚期胃癌研究領域，由首屆全國名中醫(yī)劉沈林教授領銜，開展了“中醫(yī)藥對晚期胃癌生存期影響的干預方案及推廣應用”(國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項，編號：201007007)，前期基于全國5個研究中心232例的隊列研究結果表明：晚期胃癌患者在化療的基礎上服用健脾養(yǎng)正消癥方可以延長生存期，同時改善生活質量[3]，但健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的作用機制有待明確。網絡藥理學是近年來新興的研究領域，為中藥復方多成分、多靶點、多途徑的特點提供了新的研究模式。筆者擬從網絡藥理學的角度探討健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的主要有效成分和作用靶點，為進一步深入研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1健脾養(yǎng)正消癥方有效成分和靶點的獲取 應用TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)。在“Herb name”中，分別檢索健脾養(yǎng)正消癥方中的每味中藥：黨參、白術、茯苓、山藥、薏苡仁、陳皮、木香、當歸、白芍、菝葜、石見穿、甘草，并設置篩選條件為：生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、半衰期(HL)≥4 h，從而獲得這些中藥的有效成分，合并去重。在“Related Targets”中(主要源自DrugBank數據庫)獲得上述有效成分的靶點。在Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)中查詢上述靶點，獲得對應的“Gene Name”。

1.2胃癌疾病靶點的獲取 應用GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)，在“disorders”中檢索“gastric cancer”，獲得相關靶點。在OMIM數據庫(https://omim.org/)中檢索“gastric cancer”，獲得相關靶點。將這兩個數據庫獲得的所有靶點合并去重。

1.3健脾養(yǎng)正消癥方和胃癌的共同靶點獲取 使用R3.6.3軟件獲得兩者靶點的交集，并繪制維恩圖。

1.4構建健脾養(yǎng)正消癥方有效成分-靶點調控網絡 使用Cytoscape3.8.0軟件，根據健脾養(yǎng)正消癥方有效成分和胃癌的共同靶點繪制中藥調控網絡示意圖。

1.5構建健脾養(yǎng)正消癥方蛋白互作網絡 在String數據庫(https://string-db.org/)中導入獲得的共同靶點，繪制蛋白質相互作用關系(PPI)網絡，根據數據庫返回的結果，獲得核心蛋白。

1.6GO功能富集和KEGG通路富集分析 使用R3.6.3軟件，將Gene Name轉換為Gene ID；進行GO(Gene Ontology，基因本體)功能富集分析，繪制柱狀圖；進行KEGG( Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因組百科全書)通路富集分析，繪制氣泡圖。

2 結 果

2.1健脾養(yǎng)正消癥方的有效成分和靶點 健脾養(yǎng)正消癥方12味中藥的有效成分，合并去重共152個?！坝行С煞?靶點”信息共1 917條，涉及靶點共276個。

2.2胃癌疾病靶點 在GeneCards數據庫中檢索到胃癌相關靶點1 825個，在OMIM數據庫中檢索到胃癌相關靶點170個，兩者合并去重后共1 904個。

2.3健脾養(yǎng)正消癥方和胃癌疾病的共同靶點 兩者共同靶點共135個(見圖1)。

圖1 健脾養(yǎng)正消癥方和胃癌的共同靶點維恩圖

2.4健脾養(yǎng)正消癥方有效成分-靶點調控網絡 如圖2所示，藍色的節(jié)點表示118個有效成分，綠色的節(jié)點表示135個靶點，紫色的邊1 370條表示節(jié)點間的相關作用關系。根據有效成分的自由度大小，主要有效成分有槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷固醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)、柚皮素(naringenin)等，見圖3。

圖2 健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的有效成分-靶點調控網絡

圖3 健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的主要有效成分

2.5健脾養(yǎng)正消癥方的蛋白互作網絡 如圖4所示，每個圓圈(節(jié)點)代表一個蛋白質，節(jié)點內的圖案代表該蛋白的三維結構，節(jié)點間的連線代表蛋白間的相互作用關系，連線的顏色代表相關作用類型，連線的粗細代表相互作用強度。其中，核心調控蛋白有：AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、MAPK3、MYC、EGFR、JUN、MAPK1、CCND1等，見圖5。

圖4 健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的蛋白質相互作用關系(PPI)網絡

圖5 健脾養(yǎng)正消癥方的核心調控蛋白

2.6GO功能富集和KEGG通路富集分析 如圖6所示，GO功能富集主要有：泛素樣蛋白連接酶結合(ubiquitin-like protein ligase binding)、激酶調節(jié)劑活性(kinase regulator activity)、磷酸酶結合(phosphatase binding)、泛素蛋白連接酶結合(ubiquitin protein ligase binding)、DNA結合轉錄激活劑活性/RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase Ⅱ-specific)等。如圖7所示，KEGG通路和本研究相關的富集主要有：PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、細胞衰老(Cellular senescence)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、鉑類藥物耐藥(Platinum drug resistance)等。

圖6 健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的GO功能富集分析

圖7 健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的KEGG通路富集分析

3 討 論

健脾養(yǎng)正消癥方是首屆全國名中醫(yī)、著名中醫(yī)消化腫瘤專家劉沈林教授所創(chuàng)制，由古方資生丸化裁而成。劉教授指出，晚期胃癌的病機關鍵乃脾虛正衰、癌毒彌留。治療上一是健脾養(yǎng)正，以滋養(yǎng)后天；一是化瘀消癥，以攻毒散結。方中黨參、炒白術、茯苓、淮山藥、生薏苡仁益氣健脾滲濕；陳皮、木香理氣和胃；當歸、白芍養(yǎng)血和營；菝葜、石見穿解毒抗癌；炙甘草調和諸藥。

該方藥治療胃癌共有118個有效成分，其主要成分有槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、木犀草素、豆甾醇、柚皮素、薯蕷皂苷元、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、川陳皮素、甘草查爾酮A等。槲皮素存在于甘草、石見穿中，通過阻斷胃癌干細胞中的磷酸肌醇3激酶(PI3K)-Akt信號傳導來觸發(fā)線粒體凋亡依賴性生長抑制[4]；增強胃癌化療藥物伊立替康及其代謝產物 SN-38在人AGS細胞系中的功效[5]；通過調節(jié)Akt-mTOR信號和缺氧誘導的因子1α(HIF-1α)信號來激活自噬[6]。山柰酚存在于白芍、甘草中，通過IRE1-JNK-CHOP途徑誘導自噬性細胞死亡并抑制胃癌細胞中的G9a[7]。β-谷固醇存在于當歸、白芍、菝葜、石見穿中，在體外可顯著抑制SGC-7901人胃癌細胞的生長并誘導其凋亡[8]。木犀草素存在于黨參中，調節(jié)Notch1、PI3K、AKT、mTOR、ERK、STAT3和P38信號通路，并調節(jié)一系列miRNA的表達，而對胃癌細胞產生抗癌作用[9]；木犀草素通過抑制依賴于Notch1表達的血管內皮生長因子(VEGF)分泌來抑制胃癌的血管生成和擬態(tài)血管形成[10]；通過抑制Notch1信號傳導和逆轉上皮間質轉化(EMT)來抑制胃癌進展[11]。豆甾醇存在于黨參、山藥、薏苡仁、木香、當歸中，能誘導胃癌細胞凋亡，抑制JAK/STAT信號通路[12]。柚皮素存在于陳皮、甘草中，可抑制SGC-7901細胞的增殖，遷移和侵襲并誘導細胞凋亡[13]。

健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的核心調控蛋白有：AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、MAPK3、MYC、EGFR、JUN、MAPK1、CCND1。AKT1編碼一種活性激酶，有助于胃癌的進展，促進胃癌細胞增殖[14]。IL6編碼一種細胞因子，在炎癥和B細胞成熟中發(fā)揮作用；觸發(fā)STAT3介導的miR-520d-5p抑制及其下游靶點CypB上調，調節(jié)胃癌細胞的生長和存活[15]。CASP3編碼一種蛋白酶，在細胞凋亡的執(zhí)行階段起著核心作用，CASP家族可能成為胃癌的新預后指標，有助于治療決策[16]。VEGFA編碼一種生長因子，誘導血管內皮細胞的增殖和遷移，以VEGFA為靶點的藥物貝伐單抗已上市，AVAGAST研究表明：貝伐單抗聯合化療用于晚期胃癌的一線治療可以改善無進展生存期和腫瘤緩解率[17]。

GO功能富集主要有：泛素樣蛋白連接酶結合、激酶調節(jié)劑活性、磷酸酶結合、泛素蛋白連接酶結合、DNA結合轉錄激活劑活性/RNA聚合酶Ⅱ特異性等。KEGG通路和本研究相關的富集主要有：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶-B(PI3K-Akt)信號通路、細胞衰老、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、鉑類藥物耐藥等。PI3K-Akt信號通路是最重要的細胞內通路之一，在胃癌等多種癌癥中經常被激活，通過調節(jié)細胞增殖、分化、細胞代謝和細胞骨架重組，導致細胞凋亡和癌細胞存活[18]。除了已批準的依維莫司和替西羅莫司外，許多PI3K-Akt信號通路的靶向抑制劑正在臨床研發(fā)中，如：斑蝥素通過CCAT1阻斷PI3K/Akt信號傳導通路來抑制胃癌細胞遷移和侵襲[19]，蓮心堿通過ROS生成和PI3K-Akt途徑抑制胃癌細胞的生長[20]，碘醚柳胺通過抑制PI3K/Akt/mTOR途徑促進胃癌細胞凋亡和自噬[21]。細胞衰老被認為是有效的抗癌機制，是一種永久的、不可逆的細胞周期停滯狀態(tài)，當細胞感受到各種壓力時，包括端?？s短、癌基因激活、腫瘤抑制劑失活和DNA損傷等，就會觸發(fā)細胞衰老。如有研究表明[22]，BET抑制劑JQ1通過誘導細胞衰老來抑制胃癌細胞的增殖和侵襲性，BRD4通過E2F/miR-106b-5p/p21軸調節(jié)胃癌的細胞衰老。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學的方法闡明了健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的主要有效成分為槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、木犀草素、豆甾醇等，主要作用靶點為AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、MAPK3等，通過PI3K-Akt信號通路、細胞衰老等途徑發(fā)揮抗胃癌作用，充分體現了中藥復方多成分、多靶點、多通路的調控機制，盡管網絡藥理學研究還存在一定的局限性[23]，但為健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的深入研究和開發(fā)奠定了基礎。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。