濕熱型糖穩(wěn)態(tài)失衡患者的腸道菌群特征變化研究

黃佳梅，黃 菲

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009；3. 蘇州市吳門醫(yī)派研究院，江蘇 蘇州 215009)

糖尿病是常見多發(fā)病，截止到2017年，我國(guó)18歲及以上人群糖尿病患病率達(dá)到了11.2%，其中2型糖尿病(T2DM)占90%以上[1]，大部分屬于濕熱證型[2]。糖尿病的高患病率與致死、致殘率給醫(yī)療保健部門帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)也嚴(yán)重影響國(guó)民健康及平均壽命[3]，因此做好糖尿病的防治工作具有重要的意義。早期干預(yù)，特別是對(duì)糖尿病前期及早期患者進(jìn)行有效控制有助于降低糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病率[4]。腸道菌群作為人體的內(nèi)在環(huán)境因子，它在調(diào)節(jié)新陳代謝、免疫力、炎癥和其他生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用。最近的證據(jù)表明，腸道菌群的失調(diào)可以影響宿主的肥胖、胰島素抵抗和激素分泌，共同影響T2DM的進(jìn)展，它們具有作為預(yù)防T2DM發(fā)生以及延緩T2DM進(jìn)展的新藥靶標(biāo)的潛力[5]。因此本研究通過腸道菌群細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)域的高通量測(cè)序，探討濕熱型人群的糖代謝水平與腸道菌群的關(guān)系，闡述不同糖代謝狀態(tài)濕熱型患者的菌群多樣性特征，以期為臨床基于腸道菌群靶點(diǎn)有效干預(yù)T2DM的防治提供客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1西醫(yī)糖代謝狀態(tài)分類診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2020年版)(上)》[1]：空腹血糖<6.1 mmol/L、餐后2 h血糖<7.8 mmol/L為正常血糖；空腹血糖6.1～7 mmol/L、餐后2 h血糖<7.8 mmol/L為空腹血糖受損；空腹血糖<7 mmol/L、餐后2 h血糖在7.8～11.1 mmol/L為糖耐量減低；空腹血糖≥7 mmol/L、餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L為糖尿病。其中空腹血糖受損和糖耐量減低統(tǒng)稱為糖調(diào)節(jié)受損，也稱糖尿病前期。

1.2中醫(yī)濕熱證診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》[6]，主癥：口渴，易饑，四肢倦怠，大便溏而不爽或大便秘結(jié)。兼癥：形體肥胖；心胸?zé)?，小便黃赤；口苦；腹脹滿。舌脈：舌體胖大、邊有齒痕，舌質(zhì)紅、苔黃膩，脈濡數(shù)或滑數(shù)。符合以上主癥2項(xiàng)，或主癥1項(xiàng)、兼癥2項(xiàng)，并結(jié)合舌象脈象即可診斷。

1.3納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合上述糖代謝狀態(tài)分類診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)濕熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡25～70歲(含)，性別不限；③早期T2DM病程≤2年；④受試者對(duì)本研究知情，并簽署知情同意書。

1.4排除標(biāo)準(zhǔn) ①不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)者；②正在使用對(duì)血糖有影響的藥物者；③近1個(gè)月內(nèi)服用過抗生素及微生態(tài)制劑者； ④1型糖尿病和特殊類型糖尿病者；⑤存在重大創(chuàng)傷、手術(shù)、應(yīng)激、感染、胃腸道手術(shù)史等情況者；⑥妊娠或哺乳期婦女；⑦合并其他嚴(yán)重原發(fā)疾病或精神疾病者；⑧有長(zhǎng)期慢性腹瀉史，或近1個(gè)月內(nèi)有腹瀉病或其他胃腸道疾病史者；⑨研究者認(rèn)為有不適宜參與本次研究的其他情況者。

1.5一般資料 選擇2021年4—12月在蘇州市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科門診就診及蘇州市高新區(qū)橫塘人民醫(yī)院、蘇州市滄浪新城社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心體檢的濕熱型人群100例，其中男40例，女60例，年齡(64.6±7.6)歲。

1.6研究方法 根據(jù)糖代謝水平將入選者分為健康組41例、糖尿病前期組38例、糖尿病早期組21例。收集3組人口學(xué)資料[性別、年齡、身高、體重、腰圍、體質(zhì)指數(shù)(BMI)]、臨床代謝檢測(cè)指標(biāo)[空腹血糖、餐后2 h血糖、空腹胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR，HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科與橫塘人民醫(yī)院檢驗(yàn)科完成]；采集患者的糞便，采用16S rRNA高通量測(cè)序方法進(jìn)行生物信息學(xué)分析，制作Alpha多樣性指數(shù)柱狀圖，利用SPSS 22.0軟件分析菌群差異。

1.6.1糞便樣品采集、DNA抽提和檢測(cè)方法 檢查前1 d禁酒及藥物，檢查前8 h禁食。7:00按照微基生物科技(上海)有限公司提供的糞便采集盒(專利號(hào)：ZL 2016 2 1208783.3)說明書采集糞便樣本。采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒(QIAGEN, Hilden, Germany)，嚴(yán)格按照說明書步驟提取樣本中微生物DNA。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA完整性。

1.6.216S rRNA序列擴(kuò)增和MiSeq測(cè)序方法 參考文獻(xiàn)[7-8]方法,選取16S rRNA的V3～V4區(qū)序列進(jìn)行高通量測(cè)序分析。首先將純化的DNA作為模板，利用16S rRNA V3～V4區(qū)通用引物(357F 5’-ACTCCTACGGRAGGCAGCAG-3’和806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)PCR擴(kuò)增目的片段16S rDNA V3～V4區(qū)，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)效果較好的樣本于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收,而后將回收產(chǎn)物作為模板進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，將Illumina平臺(tái)測(cè)序所需要的接頭、測(cè)序引物、標(biāo)簽序列添加到目的片段兩端。全部PCR產(chǎn)物采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)進(jìn)行回收，并用FTC-3000TMreal-time PCR儀進(jìn)行qPCR定量，均一化混勻后完成文庫(kù)構(gòu)建，然后在Illumina MiSeq 2×300 bp平臺(tái)上完成測(cè)序。第一次PCR擴(kuò)增體系：5×Buffer 10 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Phusion超保真DNA聚合酶1 IU，F(xiàn)/R內(nèi)側(cè)引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 5～50 ng，補(bǔ)充超純水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃ 2 min；24個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min，10 ℃保溫。第二次PCR擴(kuò)增體系：5xBuffer 8 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Phusion超保真DNA聚合酶0.8 IU，F(xiàn)/R外側(cè)引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 5 μL，補(bǔ)充超純水至40 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 2 min；8個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min，10 ℃保溫。

1.6.3生物信息分析方法 對(duì)測(cè)得的原始數(shù)據(jù)通過barcode分配樣品reads，得到每個(gè)樣本的有效序列，采用Trimmomatic軟件，去掉測(cè)序結(jié)果末端低質(zhì)量的序列，根據(jù)PEreads之間的overlap關(guān)系，采用flash軟件將成對(duì)的reads拼接成一條序列，同時(shí)采用mothur軟件對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，去除模糊堿基、單堿基高重復(fù)區(qū)、過長(zhǎng)和過短的序列以及PCR過程中產(chǎn)生的一些嵌合體，得到優(yōu)化序列后進(jìn)行OTU聚類(UPARSE software)，OTU代表序列與gold database(v20110519)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行物種信息注釋?；贠UT聚類分析結(jié)果，對(duì)OUT進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析(即Alpha多樣性分析)及對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè)，并繪制花瓣圖；基于物種分類學(xué)信息，在門、綱、目、科、屬水平上利用SPSS 22.0軟件對(duì)3組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選擇差異顯著(即P<0.05)的物種用柱形圖展示出來，以行可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1人口學(xué)資料及臨床代謝指標(biāo)比較 3組性別、年齡、腰圍、TC和LDL-C水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；糖尿病前期組和糖尿病早期組的BMI、HOMA-IR、TG水平均明顯高于健康組(P均<0.05)，HDL-C水平均明顯低于健康組(P均<0.05)，糖尿病前期組的HOMA-IR明顯高于糖尿病早期組(P<0.05)。見表1。

表1 濕熱型不同糖代謝狀態(tài)者人口學(xué)資料及臨床代謝指標(biāo)比較

2.2腸道菌群測(cè)序序列及稀釋性曲線分析 測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)優(yōu)化后共獲得6073681條有效序列?；贠UT聚類結(jié)果的稀釋性曲線隨樣本序列數(shù)目增加趨于平坦(見圖1)，提示測(cè)序深度合理。

圖1 濕熱型不同糖代謝狀態(tài)者糞便樣本腸道菌群測(cè)序OUT水平稀釋性曲線

2.3腸道菌群測(cè)序Alpha多樣性分析 健康組chao指數(shù)和ace指數(shù)均高于糖尿病前期組和糖尿病早期組，其中健康組與糖尿病前期組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3組間shannon指數(shù)和simpson指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，但是3組中健康組shannon指數(shù)最高、simpson指數(shù)最低。見圖2。

圖2 濕熱型不同糖代謝狀態(tài)者糞便樣本腸道菌群測(cè)序Alpha多樣性分析

2.4腸道菌群測(cè)序腸道菌群群落差異分析 在門水平上，糖尿病前期組、糖尿病早期組的Bacteroidetes(擬桿菌門)豐度均明顯高于健康組(P均<0.05)；在屬水平上，糖尿病前期組及糖尿病早期組的Blautia、Gemella豐度均明顯低于健康組(P均<

0.05)，糖尿病前期組與糖尿病早期組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；糖尿病前期組及糖尿病早期組的Acinetobacter(不動(dòng)桿菌)、Oscillospira(顫螺旋菌屬)、Anoxybacillus(厭氧芽孢桿菌屬)豐度均明顯高于健康組(P均<0.05)，且糖尿病早期組均明顯高于糖尿病前期組(P均<0.05)。其他分類水平上，3組Erysipelas(丹毒絲菌)豐度在綱、目、科三個(gè)分類水平上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，以健康組的豐度值最高；糖尿病早期組Pseudomonadales(假單胞菌目)、Moraxellaceae(莫拉菌科)的豐度明顯高于糖尿病前期組和健康組(P均<0.05)，糖尿病前期及糖尿病早期組Lachnospiraceae(毛螺菌科)的豐度均明顯低于健康組(P均<0.05)。圖3～5。

圖3 門水平濕熱型不同糖代謝狀態(tài)者差異物種豐度

圖4 屬水平濕熱型不同糖代謝狀態(tài)者間差異物種豐度

圖5 綱、目、科水平濕熱型不同糖代謝狀態(tài)者差異物種豐度

3 討 論

T2DM屬于中醫(yī)學(xué)“消渴病”范疇，以往主要包括肺熱傷津證、胃熱熾盛證、氣陰兩虛證、腎陰虧虛證、陰陽兩虛證這5種證型[9]?！毒霸廊珪吩疲骸跋什?，其為病之肇端，皆高粱肥甘之變、酒色勞傷之過，皆富貴人病之而貧賤者少也?！庇纱丝梢?，消渴病的發(fā)生多與過食肥甘及醇酒厚味密切相關(guān)，現(xiàn)代人由于生活水平與經(jīng)濟(jì)能力的提高，更多地形成了日常膏粱厚味的飲食模式，此類食品多滋膩礙胃，損傷脾胃運(yùn)化，致濕熱內(nèi)蘊(yùn)，發(fā)為“脾癉”[10]。久則脾土轉(zhuǎn)輸失職，胃雖受谷，不能運(yùn)化精微，聚而不散，隧道壅塞，清濁相混，濕郁于熱，熱又生濕，濕熱相合為病，終致消渴[11]。故而在現(xiàn)代社會(huì)環(huán)境背景下，濕熱病機(jī)貫穿T2DM的發(fā)生發(fā)展過程，是糖穩(wěn)態(tài)早期失衡的常見及主流病因，并且目前已有多項(xiàng)研究證實(shí)濕熱證型已經(jīng)成為當(dāng)前T2DM患者最常見的中醫(yī)證型[12-14]。因此本研究以濕熱證型人群作為研究對(duì)象，研究T2DM早期發(fā)生發(fā)展的影響因素，希望可以借此制定出更合適現(xiàn)代糖尿病人群的預(yù)防治療對(duì)策。

本研究發(fā)現(xiàn)，濕熱型糖尿病前期和糖尿病早期患者的BMI均顯著高于健康人，且超出正常范圍，說明濕熱加肥胖患者屬于糖尿病的好發(fā)人群,管理好自身的體重對(duì)于預(yù)防糖尿病的發(fā)生具有重要意義；糖尿病前期和糖尿病早期患者的HOMA-IR均明顯高于健康人，符合T2DM多由胰島素抵抗發(fā)展而來的機(jī)制。本研中糖尿病前期患者的HOMA-IR明顯高于糖尿病早期患者，一方面是因?yàn)樘欠€(wěn)態(tài)早期失衡時(shí)，機(jī)體通過胰島素抵抗來調(diào)動(dòng)胰島素分泌潛能來維持血糖的穩(wěn)態(tài)，另一方面也與現(xiàn)代人們對(duì)于健康越來越重視有關(guān)，隨著大眾體檢頻率的增加，以及基層糖尿病宣教工作的大量開展，使得糖尿病的確診時(shí)間不斷向前推移，已經(jīng)被確診的早期T2DM群體往往會(huì)預(yù)先注意控制飲食以及適當(dāng)加強(qiáng)鍛煉，健康的生活方式可以使他們?cè)谶m當(dāng)減重的同時(shí)改善胰島素抵抗的情況[15]。關(guān)于血脂方面，本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病前期和糖尿病早期患者較健康人具有更高水平的TG以及更低水平的HDL-C，證實(shí)了糖脂代謝紊亂是相輔相成、互相影響的。

以往對(duì)T2DM研究的重點(diǎn)是宿主代謝和激素作用，而新出現(xiàn)的證據(jù)表明腸道微生物組即定植于胃腸道的共生微生物，在T2DM發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用[5]。事實(shí)上，腸道微生物的變化可能代表了那些有T2DM風(fēng)險(xiǎn)或患有T2DM的人尚未開發(fā)的治療靶點(diǎn)。因此本研究采用腸道菌群高通量測(cè)序技術(shù)，探討濕熱體質(zhì)人群不同糖代謝水平與腸道菌群的關(guān)系。Alpha多樣性分析是反映每組樣品內(nèi)的物種菌群豐富度和均勻性的一種分析方法，其中chao指數(shù)和ace指數(shù)反映物種豐富度，shannon指數(shù)和simpson指數(shù)反映菌群多樣性和均勻度[16]。本研究Alpha多樣性分析證實(shí)，與健康人相比，糖尿病前期及糖尿病早期患者的腸道菌群豐度較健康人低；3組中物種豐度顯著上調(diào)的菌有6個(gè)，分別為擬桿菌門、不動(dòng)桿菌屬、顫螺旋菌屬、厭氧芽孢桿菌屬、假單胞菌目、莫拉菌科；豐度顯著下調(diào)的菌也有6個(gè)，分別為Blautia、Gemella、Erysipelas(綱、目、科)、毛螺菌科。豐度上調(diào)菌中，擬桿菌門、不動(dòng)桿菌屬、顫螺旋菌屬、假單胞菌目以及莫拉菌科均屬于革蘭陰性菌，革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分是脂多糖(LPS)，其為先天免疫反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑，幾乎可以刺激所有的真核細(xì)胞，導(dǎo)致全身的炎癥反應(yīng)及多器官的損傷，其主要受體是TLR-4，與之結(jié)合后可引起下游NF-κB炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，導(dǎo)致腸道屏障受損、腸壁滲漏，致使更多的致病菌及LPS循環(huán)入血，引起代謝性內(nèi)毒素血癥，從而導(dǎo)致慢性低水平炎癥及胰島素抵抗，最終發(fā)展成為T2DM[17]。厭氧芽孢桿菌屬雖然屬于革蘭陽性菌，但是其在菌屬構(gòu)成中，包括艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等具有編碼腸毒素和細(xì)胞毒素的細(xì)菌，相關(guān)毒素的產(chǎn)生也會(huì)破壞腸黏膜的完整性，導(dǎo)致腸道慢性炎癥和胰島素抵抗，進(jìn)而參與T2DM的發(fā)生[18]。豐度下調(diào)細(xì)菌中，Blautia屬的細(xì)菌可以產(chǎn)生乙酸和丁酸，可以通過增加腸道中短鏈脂肪酸的含量而減少進(jìn)入血液的LPS載量，進(jìn)而預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗等代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展[19]。而毛螺菌科中的很多物種也都是丁酸鹽產(chǎn)生菌，具有修復(fù)腸道黏膜屏障的作用[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，丹毒絲菌的富集與更堅(jiān)固的腸道屏障黏液層的形成是正相關(guān)的，隸屬于它的某些菌種也已被證實(shí)與腸道黏液的形成與性質(zhì)有關(guān)，可見在糖尿病前期與糖尿病早期患者血糖代謝功能紊亂的發(fā)展過程中，丹毒絲菌發(fā)揮了一部分作用，丹毒絲菌的豐度下降，可導(dǎo)致腸道屏障功能減弱，引發(fā)腸道細(xì)菌易位，誘發(fā)腸道慢性炎癥及胰島素抵抗[21]。Gemella是人體口腔、呼吸道、腸道的正常菌屬，其與部分組織器官的感染有關(guān)，但其與糖脂代謝的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究[22]。以上這些特異性變化菌與糖穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān)，通過多種發(fā)病機(jī)制參與了T2DM的發(fā)生。相關(guān)藥物方面的研究也支持這一觀點(diǎn)，如徐佳[19]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過增加有益菌Blautia屬的含量來改善患者血糖和血脂代謝；黃芩-黃連藥對(duì)可通過增加Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae的豐度達(dá)到降低血糖的目的[21]；參芪復(fù)方可通過調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制慢性促炎因子的表達(dá)，減輕非特異性炎癥反應(yīng)，從而改善胰島素抵抗[23]。

綜上所述，糖穩(wěn)態(tài)失衡患者即糖尿病前期與糖尿病早期患者的腸道菌群往往富集更多的革蘭陰性菌及其他有害菌，而丁酸鹽產(chǎn)生菌等有益菌豐度較健康人明顯下降。本研究共發(fā)現(xiàn)12個(gè)菌群在健康人與糖穩(wěn)態(tài)失衡患者間存在顯著差異，這些特異性變化菌可能是參與T2DM發(fā)生過程的醫(yī)學(xué)特征菌，可能可以作為新的治療方案的參考點(diǎn)，為后期基于腸道菌群靶向防治T2DM提供參考。由于人體內(nèi)腸道菌群的影響因素眾多，包括人體自身基因、飲食結(jié)構(gòu)和藥物使用等[24-25]，本研究?jī)H排除了抗生素，沒有排除患者其他用藥及飲食嗜好等方面對(duì)研究人群腸道菌群的影響，但選擇了濕熱型研究對(duì)象(一般具有相同的飲食嗜好)作為彌補(bǔ)；另外由于臨床所限，本研究樣本量較少，也沒有加入非濕熱證人群研究；本研究屬于橫斷面研究，缺乏對(duì)腸道菌群的連續(xù)性變化研究，這些都是本研究存在的不足之處。未來需要進(jìn)一步開展更大隊(duì)列的臨床研究，盡量減少影響人體腸道菌群的多種因素，更全面地了解不同血糖代謝水平人群的腸道菌群特點(diǎn)，特別是作為“典型”的濕熱證人群糖穩(wěn)態(tài)不同時(shí)期的腸道菌群特征，以期探明腸道菌群在糖耐量異常的形成和T2DM的發(fā)生過程中的作用及機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。