C3 在結(jié)核免疫中的作用及研究進(jìn)展*

劉建新 何樹梅 駱?biāo)贾?/p>

1 西藏民族大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 2.生命科學(xué)高校重點實驗室 陜西咸陽 712082

結(jié)核病是一種有著數(shù)萬年歷史的慢性傳染病[1]。時至今日，結(jié)核病依然給科研人員及醫(yī)療人員帶來困擾。根據(jù)世衛(wèi)組織關(guān)于2020 年結(jié)核病的報告，2019 年全世界約有1000 萬新的結(jié)核病例，其中約140 萬人死于結(jié)核病，且近幾年處于一個穩(wěn)定的增長水平[2]?？菇Y(jié)核一線和二線藥物療程長，副反應(yīng)較大[2]。而唯一的疫苗——卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine，BCG Vaccine）普遍認(rèn)為對兒童的肺結(jié)核有較好的預(yù)防作用，而對成人肺結(jié)核的預(yù)防效果較差[3]。近些年來，由于耐藥菌株的出現(xiàn)，以及與人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）共同感染，對全球結(jié)核病的控制引起了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[4]。雖然全球和我國在抗結(jié)核方面取得了巨大的進(jìn)步，但距聯(lián)合國提出的2035 年終止結(jié)核病的目標(biāo)差距還很大[5]。因此，加快研究結(jié)核病的詳細(xì)發(fā)病機制，診斷方法，疫苗及藥物迫在眉睫。補體系統(tǒng)是固有免疫和特異性免疫的重要構(gòu)成部分，是由30 多種可溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白組成，在免疫防御中是抗體發(fā)揮溶菌、溶細(xì)胞作用的必要補充條件[6]。補體級聯(lián)反應(yīng)可由經(jīng)典途徑、旁路途徑、甘露糖結(jié)合凝集素途徑這三條途徑所激活，最終形成膜攻擊復(fù)合物(Membrane Attack Complex，MAC),從而介導(dǎo)靶細(xì)胞溶解、破裂[7]。C3 是補體系統(tǒng)中的核心成分，位于三條激活途徑的交叉位點。已有研究表明，結(jié)核分枝桿菌肝素結(jié)合血凝素蛋白（Heparin-binding Hemagglutinin Protein,HbhA）可以與人的C3 結(jié)合[8]，但具體機制不詳。Risalde 等[9]發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌IV 疫苗可保護(hù)斑馬魚免受海洋分枝桿菌的入侵的機制是通過C3 激活天然免疫應(yīng)答。所以研究C3 在結(jié)核分枝桿菌入侵機體后激活的機制及所起的作用，對于研發(fā)新的疫苗和藥物有重大的意義。本文將對C3 在結(jié)核免疫中的作用及研究進(jìn)展做一綜述。

1 C3 在補體系統(tǒng)中的鑒定及進(jìn)化

1.1 C3 在補體系統(tǒng)中位于中心地位

經(jīng)典途徑、甘露糖結(jié)合凝集素途徑、旁路途徑都可以形成C3 轉(zhuǎn)化酶，可裂解C3 為C3a 和C3b，C3a游離在液相中，C3b 與C3 轉(zhuǎn)化酶結(jié)合，形成C5 轉(zhuǎn)化酶，C5 轉(zhuǎn)化酶可使C5 分解為C5a 和C5b，C5b 沉積在細(xì)胞膜表面，依次和C6、C7、C8、n 個C9 結(jié)合形成MAC，MAC 插入靶細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層中，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞溶解、破裂從而發(fā)揮溶菌、溶病毒及細(xì)胞毒作用[10-12]。FI 在輔因子存在的情況下裂解C3b 生成iC3b，在Cr1 存在的情況下，F(xiàn)I 繼續(xù)裂解iC3b 形成C3dg，最后形成C3d，C3c 在裂解過程中被釋放[13]。

1.2 C3 的進(jìn)化及鑒定

C3 是補體系統(tǒng)中的核心成分，最早出現(xiàn)于7 億多年前，屬于α2-巨球蛋白家族，由C3 基因編碼。C3基因在哺乳動物及魚類的進(jìn)化史上發(fā)生了三次正向選擇，由于水生和陸生生態(tài)環(huán)境的不同，魚類和哺乳動物的C3 基因有不同的進(jìn)化發(fā)展方式[14]。人的C3 是由19 號染色體上的41kb 的單個C3 基因編碼的[15]，由115kDa 的α 鏈和75kDa 的β 鏈組成，由一個二硫鍵連接[16]。

2 C3 和分枝桿菌的相互作用

為了驗證C3 是否與分枝桿菌結(jié)合，并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。Risalde 等通過C3 配體親和印跡的方法，從結(jié)核分枝桿菌中鑒定出一個30kDa 的可以與C3 結(jié)合的蛋白并且該蛋白位于結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞膜上，這個蛋白的氨基酸序列與分枝桿菌的HbhA 蛋白相匹配。但是未證明C3 的哪個部位與HbhA 的賴氨酸-丙氨酸重復(fù)序列結(jié)合。該蛋白通過與C3 結(jié)合，可能與巨噬細(xì)胞表面的補體受體CR3 結(jié)合，從而啟動先天性免疫應(yīng)答。Mueller-Ortiz 等[17]則在實驗中，利用一株HbhA 表達(dá)缺失的結(jié)核分枝桿菌的突變體感染小鼠，以確定HbhA 是否在C3 介導(dǎo)的結(jié)核分枝桿菌粘附或攝取的單核細(xì)胞中起作用。結(jié)果表明模型組和對照組小鼠的巨噬細(xì)胞在于結(jié)核分枝桿菌的粘附、吞噬、存活方面無任何差異。對HbhA 突變株進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)了與C3 結(jié)合的結(jié)核分枝桿菌另一種結(jié)合蛋白HupB。Ferguson 等[18]利用不同濃度的新鮮非免疫性的人血清和人支氣管肺泡灌洗液證明了結(jié)核分枝桿菌可以與C3裂解產(chǎn)物C3b 或iC3b 共價結(jié)合，導(dǎo)致人支氣管肺泡液中巨噬細(xì)胞的吞噬能力增強，并且證明了經(jīng)典途徑比旁路途徑發(fā)揮更大的作用。Risalde 等[19]發(fā)現(xiàn)用牛分枝桿菌疫苗浸泡斑馬魚，發(fā)現(xiàn)浸泡后的斑馬魚對海分枝桿菌的入侵有較好的控制效果。這種保護(hù)作用是通過減少海洋分枝桿菌感染、每個肉芽腫中的海分枝桿菌數(shù)量和的肉芽腫數(shù)量來實現(xiàn)的，并且功能研究表明，牛分枝桿菌IV 疫苗通過斑馬魚腸道、鰓等器官表面的TLR 受體從而激活C3 來介導(dǎo)補體級聯(lián)反應(yīng)來啟動天然免疫應(yīng)答。由此可見，C3 在天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著非常重要的作用。Gortazar 等[20]給歐亞野豬注射牛分枝桿菌卡介苗并隨后用牛分枝桿菌野生型菌株攻擊野豬，發(fā)現(xiàn)卡介苗接種后野豬的C3 明顯高于對照組，但在分枝桿菌攻擊后C3 水平隨即顯著下降。Beltrán-Beck 等[21]用牛分枝桿菌滅活的疫苗攻擊野豬，證明分枝桿菌通過一種未知的機制激活C3 從而誘導(dǎo)先天性免疫和適應(yīng)性免疫的激活。但Bohlson 等[22]利用C3缺乏的小鼠感染鳥分枝桿菌，卻驚奇的發(fā)現(xiàn)C3 缺陷小鼠與野生型小鼠相比，細(xì)菌負(fù)荷和肉芽腫方面卻無較大的差異性表現(xiàn)。C3 過表達(dá)的小鼠與C3 缺陷的小鼠對鳥分枝桿菌有相同的敏感性。無C3 的情況下與有補體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答比較，小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬鳥分枝桿菌的能力增強。提示宿主存在其它受體來代償C3 的缺失去介導(dǎo)與鳥分枝桿菌的結(jié)合而引起免疫應(yīng)答。

3 其它補體成分與分枝桿菌相互作用

已有研究表明，補體系統(tǒng)的其它成分也可與分枝桿菌結(jié)合。Carroll 等[23]證明了牛分枝桿菌卡介苗在經(jīng)典途徑中有無抗體存在的條件下都可以與人血清C1q 結(jié)合，只是在IgM 或IgG 存在的情況下可與C1q的結(jié)合增強2～3 倍。旁路途徑的激活無抗體依賴性，H 因子也與之結(jié)合。在凝集素途徑中，人血清中甘露糖結(jié)核凝集素和L 型纖維膠原素可與牛分枝桿菌卡介苗結(jié)合，隨后激活MASP2，導(dǎo)致補體級聯(lián)反應(yīng)的激活，但H 型纖維膠原素不能與之結(jié)合。而且同時證明了C3b 沉積在靶細(xì)胞膜上。補體受體中已證明結(jié)核分枝桿菌與巨噬細(xì)胞表面的補體受體CR3[24]、CR4[25]結(jié)合，結(jié)核分枝桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后會使巨噬細(xì)胞啟動天然免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮抗結(jié)核分枝桿菌的作用。Cabec 等[26]使用了可穩(wěn)定表達(dá)人非吞噬作用的CR3 的倉鼠卵巢細(xì)胞研究CR3 介導(dǎo)的由iC3b 包被的調(diào)理吞噬作用和非調(diào)理吞噬作用，發(fā)現(xiàn)在吞噬過程中通過不同的CR3 結(jié)合位點發(fā)生了不同的吞噬機制。Melo 等[27]利用CD11b 基因敲除小鼠CR3，發(fā)現(xiàn)CR3 介導(dǎo)了40%～50%的結(jié)核分枝桿菌與巨噬細(xì)胞的結(jié)合。而且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌在體外巨噬細(xì)胞模型和小鼠感染模型中的的存活和復(fù)制并沒有受到CR3 缺失的影響。這提示巨噬細(xì)胞表面有其它受體來介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞。Rooyakkers 等同樣利用CR3 基因敲除的小鼠，卻發(fā)現(xiàn)缺少CR3 會導(dǎo)致活菌的攝取減少50%，但對巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧及活性氮中間產(chǎn)物的誘導(dǎo)及干擾素-y 激活的巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌的生長沒有影響。Zaffran 等[25]證明了CR4 通過調(diào)理素iC3b 參與人單核巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌吞噬作用，在沒有調(diào)理素的作用下，結(jié)核分枝桿菌可通過CR4 直接與巨噬細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合，這種結(jié)合可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中一個60kDa 蛋白迅速酪氨酸磷酸化。

4 C3 及其裂解片段與部分免疫細(xì)胞的相互作用

Kopf 等[29]證明了C3 缺陷的小鼠對初次感染流感病毒的高敏感度。C3 缺陷的小鼠出現(xiàn)病毒清除延遲，肺部病毒滴度增加，肺引流淋巴結(jié)中T 輔助細(xì)胞的啟動減少，CD4+T、CD8+T 細(xì)胞向肺內(nèi)募集的功能嚴(yán)重受損。C3a 不僅對中性粒細(xì)胞有趨化作用，C3a 還可以與樹突狀細(xì)胞（DC）直接結(jié)合，調(diào)節(jié)小鼠骨髓DC的激活和功能。C3aR 在多種髓系細(xì)胞和非髓系細(xì)胞上都有表達(dá)。C3aR 在DC 上也有表達(dá)，在缺乏C3aR 的小鼠中，DC 表型活化程度降低，抗原攝取和提呈能力下降，并且體內(nèi)外刺激同種異體T 細(xì)胞反應(yīng)能力降低。C3aR 同時也在T 細(xì)胞上表達(dá)，并上調(diào)T 細(xì)胞的活化[30]。C3b 與外來病原體表面結(jié)合可形成復(fù)合物，被APC 上補體受體所攝取，然后通過主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）II 類分子傳遞給T 細(xì)胞，從而激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答[31]。B 細(xì)胞表達(dá)CR2（CD21）,可與結(jié)合了C3d 和iC3b 的抗原表面相互作用，誘導(dǎo)B 細(xì)胞受體信號增加[32]。

5 結(jié)論和展望

以上重點總結(jié)了C3 在結(jié)核免疫中的作用及研究進(jìn)展以及部分補體成分與分枝桿菌的結(jié)合及C3 及其裂解片段與部分免疫細(xì)胞之間的相互作用。C3 在結(jié)核分枝桿菌侵襲機體時發(fā)揮了重要作用，但關(guān)于C3 及其它補體成分在結(jié)核分枝桿菌侵入機體后的詳細(xì)機制尚不清楚，如結(jié)核分枝桿菌是如何逃避補體系統(tǒng)的，補體的三條途徑是否在結(jié)核分枝桿菌入侵機體的過程中都發(fā)揮了作用，如果發(fā)揮了作用，哪條補體通路最先發(fā)揮作用，又是哪一條通路的貢獻(xiàn)最大，補體系統(tǒng)每個成分都發(fā)揮著怎樣的作用，補體系統(tǒng)和其它免疫細(xì)胞之間是如何的相互作用的。雖然已經(jīng)研究證明C3可以與結(jié)核分枝桿菌的HbhA 和HupB 蛋白可以結(jié)合，但詳細(xì)的結(jié)合機制尚不清楚。還有人用C3a 抑制劑用來減少局部的炎癥反應(yīng)。但目前關(guān)于補體系統(tǒng)在結(jié)核病的發(fā)病機制中的鮮有報道。研究C3 在結(jié)核免疫中的作用會為我們研究補體系統(tǒng)在結(jié)核病的發(fā)病機制中所起的作用填補許多空白，為探究結(jié)核分枝桿菌的詳細(xì)發(fā)病機制及藥物和疫苗的研發(fā)提供可鑒之處。