藏藥小檗皮粗提物對人胃癌細胞株細胞活性及周期的影響*

劉章程 桑旦旺姆 袁瑞瑛 喬蓓★

1 西藏自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科 2 西藏大學醫(yī)學院藥學系 西藏拉薩 850000

胃癌是全球第5 位常見腫瘤，目前約3/4 的新發(fā)病例發(fā)生于亞洲，我國是胃癌重災(zāi)區(qū)，亞洲胃癌新發(fā)病例中我國新發(fā)病例超過2/5[1]。在我國，胃癌居男性癌癥發(fā)病第2 位及女性第5 位，居男性癌癥死亡第3位及女性第2 位[2]。有學者抽取2004～2005 年全國第3次死因回顧調(diào)查西藏自治區(qū)1 市4 縣惡性腫瘤死亡資料（覆蓋總?cè)四陻?shù)為388626 人）發(fā)現(xiàn)：胃癌是西藏前5 位惡性腫瘤死因的第一位[3]。可見胃癌是威脅全區(qū)人民健康、增加家庭和社會負擔的主要惡性腫瘤，對其進行積極防治顯得尤為必要與重要。

目前胃癌的標準治療主要有手術(shù)、放療及包括化療、分子靶向、免疫治療等的全身系統(tǒng)治療。本區(qū)患者就診時多為中晚期，多已無手術(shù)機會，以全身系統(tǒng)治療及姑息治療為主。當前胃癌的治療藥物種類較少，化療、靶向及免疫藥物毒副反應(yīng)較重，有些種類不易獲及且花費昂貴。面對藏區(qū)胃癌治療的現(xiàn)狀，臨床治療中迫切需要本地易獲及且花費不高的新型藥物出現(xiàn)。藏藥在本地區(qū)歷史悠久，許多患者愿意嘗試傳統(tǒng)藥物進行治療，且藏藥在經(jīng)濟成本上具有顯著優(yōu)勢,故本研究擬嘗試從傳統(tǒng)藏藥中發(fā)掘抗胃癌腫瘤活性藏藥，為胃癌的診治提供新的思路和途徑。

藏藥小檗皮始載于《四部醫(yī)典》，藏文譯音“吉爾哇”、“杰星”、“給爾馴”等。產(chǎn)于西藏拉薩及其周邊地區(qū)海拔3660～4400 米的山坡灌叢中，有研究表明墨竹工卡和工布江達縣附近的小檗其活性成分小檗堿含量較高，具有較高的應(yīng)用價值。《晶珠本草》記載:“小檗皮性涼、糙,能斂諸毒，干黃水”。有研究表明小檗皮中的小檗堿具有多種藥理作用,包括抗病原微生物、抗炎、抗腫瘤、心臟保護、降血糖、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝以及免疫抑制等。對人肝癌細胞HepG2、SMMC-7721、胃癌細胞BGC-803 等有一定的抑制作用。[4,5]本研究根據(jù)臨床用藥實踐和文獻調(diào)研確定以人胃癌細胞株BGC-803、BGC-823、SGC-7901 和藏藥小檗皮為研究對象，通過體外藥效學實驗數(shù)據(jù)信息，探討小檗皮治療胃癌的細胞機制，為胃癌的臨床治療提供新的思路，為傳統(tǒng)民族藥的現(xiàn)代化研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物提取

將干燥的小檗皮進行粉碎，與70%乙醇按質(zhì)量比1：10 混合后加熱至微沸，回流提取2h，過濾；濾渣與70%乙醇按照相同比例繼續(xù)提取2h。合并兩次濾液，減壓濃縮至浸膏，置于烘箱中烘干至粉末，用DMSO（二甲基亞砜）溶解小檗堿純品得到母液。

1.2、MTT 法檢測藏藥小檗皮粗提取物對人胃癌細胞株活力的影響

1.2.1 實驗材料

MTT（噻唑藍）(BioFROXX,CAT.NO:3580GR005)，PBS（硫酸緩沖鹽溶液）溶解的小檗皮粗提物和DMSO 溶解的小檗堿純品，人胃癌細胞株BGC803、BGC823、SGC7901。

1.2.2 實驗方法

取對數(shù)生長期的人胃癌細胞BGC803、BGC823、SGC7901 分別接種于 96 孔板中，每孔3000 個細胞；置于孵箱培養(yǎng) 12～24h，使得細胞完全貼壁生長后，加入不同濃度的PBS（硫酸緩沖鹽溶液）溶解的小檗皮粗提物和DMSO（二甲基亞砜）溶解的小檗堿純品；繼續(xù)培養(yǎng)48h 后，每孔加入20μl MTT 溶液(5mg/ml），孵育4h 后，用移液器吸去孔內(nèi)液體，每孔加入100μl DMSO，使結(jié)晶溶解，使用全波長酶標儀在570nm 和 630nm 波長處檢測各孔的吸光度，計算生長抑制率。計算公式如下：細胞活力%=加藥組細胞平均吸光值/對照組細胞平均吸光值×100%，根據(jù)孫氏綜合法（改進寇氏法）計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.3 流式細胞術(shù)檢測小檗皮粗提取物對人胃癌細胞周期阻滯的影響

1.3.1 實驗材料

Propodium iodide（BioFrox,CAT.NO:1246MG010）,RNase A (Yeasen,CAT.NO:10405ES03)，PBS 溶解的小檗皮粗提物和DMSO 溶解的小檗堿純品，人胃癌細胞株BGC803、BGC823、SGC7901。

1.3.2 實驗方法

取對數(shù)生長期的人胃癌細胞BGC803、BGC823、SGC7901 分別接種于12 孔板中，每孔1×105 個細胞；置于孵箱 24h 后，加入不同濃度的 PBS 溶解的小檗皮粗提物和DMSO 溶解的小檗堿純品；繼續(xù)培養(yǎng)48h 后，用不含EDTA 的胰酶消化細胞，終止消化后收集細胞，1000rpm、4℃離心5min，棄上清；用PBS 洗滌細胞一次，1500rpm，5min 離心收集，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml,取1ml 單細胞懸液離心后，去除上清，在細胞中加入70%預冷乙醇500ul 固定2 小時至過夜，4℃保存，染色前用PBS 洗去固定液，用200μl PBS 重懸細胞，加20μlRNase A(10mg/ml) 溶液，37℃水浴 30min；再加入200μl PI 染色液(PI 10mg/ml,TritonX-100 0.2%)混勻，4℃避光孵育30min；上機檢測，記錄激發(fā)波長 488nm處紅色熒光值，使用 FlowJo 軟件分析細胞周期變化。

2 實驗結(jié)果

2.1 MTT 法檢測藏藥小檗皮粗提取物對人胃癌細胞活力的影響

圖2 MTT 法檢測小檗皮堿純品粗提物對胃癌細胞活力的影響

MTT法結(jié)果：圖1、2顯示，人胃癌細胞BGC803,BGC823,SGC7901對小檗皮粗提物的IC50分別為1.4mg/ml,2.8mg/ml,1.3mg/ml;對小檗堿純品的 IC 50 分別為39.63μM,48.01μM,96.15μM。由圖可見小檗皮粗提物及小檗堿純品（陽性對照）對人胃癌細胞株的細胞活力抑制作用均隨著藥物濃度增加。

圖1 MTT 法檢測小檗皮粗提物對胃癌細胞活力的影響

2.2 流式細胞術(shù)檢測藏藥小檗皮粗提物對人胃癌細胞周期阻滯的影響

2.2.1 流式細胞術(shù)檢測小檗皮粗提物結(jié)果

圖3 顯示小檗皮粗提物可以使 BGC803 細胞發(fā)生S 期阻滯；圖4 顯示小檗皮粗提物的對BGC823 細胞周期無明顯影響；圖5 顯示小檗皮粗提物可以使SGC7901 細胞發(fā)生G2 期阻滯。

圖3 PI 單染檢測小檗皮粗提物對BGC803 細胞的周期作用

圖4 PI 單染檢測小檗皮粗提物對BGC823 細胞的周期作用

圖5 PI 單染檢測小檗皮粗提物對SGC7901 細胞的周期作用

2.2.2 流式細胞術(shù)檢測小檗堿純品（陽性對照）結(jié)果

圖6 顯示小檗堿純品10μM、20μM、40μM 劑量均可以使BGC803 細胞發(fā)生S 期阻滯；圖7 顯示小檗堿純品12μM、24μM、48μM 劑量均可以使BGC823 細胞發(fā)生G2 期阻滯；圖8 顯示小檗堿純品24μM、48μM、96μM 劑量均可以使SGC7901 細胞發(fā)生S 期阻滯。

3 結(jié)論

圖6.PI 單染檢測小檗堿純品對BGC803 細胞的周期作用

圖7.PI 單染檢測小檗堿純品對 BGC823 細胞的周期作用

圖8.PI 單染檢測小檗堿純品對SGC7901 細胞的周期作用

多個研究表明小檗堿有確定的抗腫瘤作用。在胃癌MGC 803 細胞中，小檗堿可影響MAPK 信號通路，抑制MGC 803 細胞增殖，并且其抑制作用具有時間依賴性和濃度依賴性[6]。小檗堿與d-檸檬烯1 ∶4 配伍使用時，能通過誘導MGC 803 細胞內(nèi)活性氧的生成、細胞周期阻滯作用和線粒體介導的內(nèi)在途徑所誘導的細胞凋亡來達到協(xié)同抗腫瘤作用[7]。小檗堿可調(diào)節(jié)多個參與細胞凋亡的信號通路，降低乳腺癌MDA-MB-231細胞存活率，最終誘導細胞凋亡[8]。在人乳腺癌細胞MCF-7 裸鼠移植瘤模型中，小檗堿也表現(xiàn)出較好的抑制腫瘤生長的作用，而且這種抑制作用呈濃度依賴性[9]。此外，小檗堿還能夠協(xié)同柔紅霉素治療白血病，加強紫杉醇抗胃腸道腫瘤的作用[10]。小檗堿為藏藥小檗皮粗提物中主要成分之一。本試驗結(jié)果也證實：參照陽性對照藥物小檗堿純品，藏藥小檗皮粗提物可以抑制實驗人胃癌細胞株BGC803、BGC823、SGC7901 細胞的活力，且隨著藥物濃度增加，抑制細胞活性程度越明顯。同時可以誘導本實驗相關(guān)人胃癌細胞株細胞發(fā)生S期阻滯及G2 期阻滯。本研究對象藏藥小檗皮粗提物具有潛在抗胃癌細胞活性及抑制胃癌細胞周期作用，為拓寬傳統(tǒng)民族藥物的臨床應(yīng)用提供了初步的思路和理論依據(jù)。同時，因本為初步探索性實驗，小檗皮粗提物的確切化學成分及其具體含量還需進一步提純分析，主要化學成分的具體抗腫瘤機制還需進一步實驗驗證。細胞、動物水平進行的實驗不能完全代表臨床療效，這些作用能否真正應(yīng)用于臨床治療還需進一步臨床研究。臨床應(yīng)用劑量、毒副作用及安全性也需要更多的循證醫(yī)學研究驗證。