宮腔菌群調(diào)控宮腔微環(huán)境影響胚胎著床的研究進展

任姝晴，郭潔，宋殿榮

目前全球約有8%～12%的育齡夫婦遭受不孕癥的困擾，不孕癥的病因和治療已成為研究重點[1]。近年輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）的發(fā)展為不孕癥患者帶來生育的希望，但目前每個體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）周期的活產(chǎn)率僅為25%～30%[2]。據(jù)報道大部分反復(fù)著床失?。╮epeated implantation failure，RIF）是由子宮內(nèi)膜容受性不足引起的，因此，良好的子宮內(nèi)膜容受性對胚胎著床具有重要意義。隨著人體微生物組學(xué)研究的興起，20 世紀初提出的“無菌子宮”這一傳統(tǒng)理念越來越受到關(guān)注。在人類微生物組計劃（Human Microbiome Project，HMP）的背景下，過去10 年下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)的使用拓寬了微生物領(lǐng)域的研究，并提供了檢測復(fù)雜微生物群落的可能性[3]，逐漸開展了某種特定微生物的存在對生殖的影響以及是否有助于胚胎植入和妊娠的研究[4]。女性生殖道微生物群可能影響包括受精、胚胎著床、胚胎生長以及妊娠維持等生殖過程。如果生殖道微生物群在妊娠前就影響了子宮的免疫微環(huán)境，這將顯著影響子宮內(nèi)膜容受性以及正常胎盤初始化形成的能力?，F(xiàn)就宮腔菌群影響胚胎著床的可能機制作一綜述。

1 宮腔共生菌群的構(gòu)成

人體內(nèi)居住著數(shù)萬億的微生物，共生菌群是人體內(nèi)固有的正常菌群。正常情況下，宮腔菌群構(gòu)成一個有機整體，始終維持著健康穩(wěn)定的狀態(tài)。目前對正常宮腔菌群構(gòu)成的定義尚未達成共識，與陰道菌群相比，宮腔菌群數(shù)量較低，但多樣性較高[5]。宮腔菌群的多樣性和豐度由高到低依次為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，厚壁菌門中的乳桿菌屬是宮腔內(nèi)的優(yōu)勢菌[6]。2018 年Kyono 等[7]經(jīng)人工授精導(dǎo)管（減少陰道和宮頸的污染）取材，對7 名健康女性志愿者的子宮內(nèi)膜組織進行16S 核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）測序發(fā)現(xiàn)，有6 名女性乳桿菌含量＞90%，另外還檢測出了少量加德納菌、鏈球菌、阿托波姆菌、雙歧桿菌、纖毛菌、普雷沃菌和葡萄球菌。該研究還發(fā)現(xiàn)健康女性子宮內(nèi)膜乳桿菌百分比在同一個月經(jīng)周期不同階段高度穩(wěn)定，甚至在下一個周期也是穩(wěn)定的。2022 年Moreno 等[6]的研究也表明乳桿菌是子宮內(nèi)膜組織中最豐富的一個屬，而其他細菌即厭氧菌，如阿托波姆菌、雙歧桿菌和加德納菌比例較低，構(gòu)建共生細菌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)乳桿菌數(shù)量與加德納菌、雙歧桿菌和阿托波姆菌呈負相關(guān)，與共生菌梭狀芽孢桿菌和鏈霉菌呈正相關(guān)。

另有研究認為宮腔菌群并非以乳桿菌為優(yōu)勢菌。2019 年Winters 等[8]在25 例因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)患者的子宮樣本中發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜微生物群主要由不動桿菌、梭狀芽孢桿菌、叢毛單胞菌和假單胞菌組成，而子宮內(nèi)乳桿菌屬罕見，然而該研究并不能除外這些細菌與子宮肌瘤具有一定的相關(guān)性。同年，Leoni 等[9]納入了19 例正常足月妊娠的剖宮產(chǎn)婦女，在新生兒分娩、胎盤和胎膜從子宮排出后不久，通過子宮內(nèi)膜活檢進行取樣，發(fā)現(xiàn)6 個可分類的菌屬（表皮菌屬、大腸桿菌屬、葡萄球菌屬、不動桿菌屬、鏈球菌屬和棒狀桿菌屬），它們可能是核心子宮內(nèi)膜微生物群的一部分。該研究為今后探討細菌與成功妊娠間的關(guān)系提供了有用的信息。由于16S rRNA 測序不能區(qū)分活細菌或死細菌片段，子宮內(nèi)膜微生物組是否包含真正活躍的微生物目前尚不清楚，因此，2021年Sola-Leyva 等[10]使用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對7 名健康育齡期女性的14 個配對樣本（包括增殖期和分泌中期）的子宮內(nèi)膜活檢組織進行分析，發(fā)現(xiàn)了由5 326種具有轉(zhuǎn)錄活性的微生物群組成的健康女性子宮內(nèi)膜微生物組，包括85%細菌、10%真菌、5%病毒和0.3%古細菌；其中肉毒梭狀芽孢桿菌、嗜氫菌、肺炎克雷伯菌和巴斯德氏菌是最豐富的微生物。基于以上研究，是否所有女性都存在獨特的宮腔菌群，檢測到的細菌是否暫時或永久存在于子宮內(nèi)以及宮腔內(nèi)各種菌群的共生關(guān)系仍需進一步研究。

2 不孕癥患者宮腔菌群對妊娠結(jié)局的影響

正常生理情況下，宮腔共生菌群對妊娠維持起著重要的作用，當(dāng)共生菌群紊亂時會降低IVF 的成功率。研究認為宮腔內(nèi)乳桿菌可為ET 和妊娠維持提供理想的宮腔內(nèi)環(huán)境，但是目前有關(guān)宮腔菌群與生殖結(jié)局的相關(guān)性還未達成共識。2016 年Moreno等[11]報道，將子宮內(nèi)膜液中的菌群分為以乳桿菌為主的菌群（Lactobacillus dominated microbiota，LDM）和非乳桿菌為主的菌群（non-Lactobacillus dominated microbiota，NLDM），LDM≥90%與胚胎著床率、妊娠率、持續(xù)妊娠率和活產(chǎn)率提高有關(guān)，而以加德納菌屬和鏈球菌屬為優(yōu)勢菌的NLDM 對妊娠有著不良影響。有研究表明，加德納菌、鏈球菌、腸球菌、葡萄球菌、支原體、脲原體、衣原體和奈瑟菌等微生物與慢性子宮內(nèi)膜炎有關(guān)，進而對胚胎著床產(chǎn)生不利影響[12]。2019 年Kyono 等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，LDM≥80%已達到胚胎植入條件，另外雙歧桿菌占優(yōu)勢的子宮內(nèi)膜菌群也創(chuàng)造了胚胎植入的良好環(huán)境。該研究還發(fā)現(xiàn)LDM組的妊娠率（58.9%）高于NLDM 組（47.2%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對于NLDM 患者，根據(jù)其個體的微生物狀況使用抗生素或益生元/益生菌可提高胚胎著床率。該研究明確了不孕癥患者的子宮內(nèi)膜微生物狀態(tài)對妊娠具有重要意義，恢復(fù)以乳桿菌為主的子宮內(nèi)膜可能有利于胚胎植入。但也有研究結(jié)果相反，2019 年Hashimoto 等[14]對99 例進行IVF治療的不孕癥患者的子宮內(nèi)膜組織進行16S rRNA測序，將子宮內(nèi)膜微生物群分為菌群正常組（≥80%的乳桿菌和雙歧桿菌屬）和菌群失調(diào)組（＜80%的乳桿菌和雙歧桿菌屬，≥20%的其他細菌），2 組的胚胎著床率（52.9% vs.53.1%）、流產(chǎn)率（11.1% vs.5.9%）和妊娠率（52.9% vs.54.8%）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），這表明不同的宮腔菌群特征不一定影響妊娠結(jié)局。2022 年Moreno 等[6]開展了一項前瞻性多中心觀察性研究，對342 例不孕癥患者的子宮內(nèi)膜組織進行測序后發(fā)現(xiàn)，高豐度的乳桿菌與活產(chǎn)率有關(guān)，乳桿菌可能是IVF 治療成功的生物標志物。接受IVF治療的患者宮腔中阿托波姆菌、雙歧桿菌、黃桿菌、加德納菌、嗜血桿菌、克雷伯菌、奈瑟菌、葡萄球菌和鏈球菌的存在與較差的預(yù)后（如妊娠失敗、生化妊娠或臨床流產(chǎn)）有關(guān)，其中加德納菌、克雷伯菌和鏈球菌在未妊娠患者中顯著增加，克雷伯菌和葡萄球菌與臨床流產(chǎn)有關(guān)，生化妊娠的患者以腸球菌居多。因此，推測接受IVF 治療患者的妊娠結(jié)局受宮腔中細菌群落及其與宿主間相互作用的影響。藺凱麗等[15]研究了37 例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者（recurrent spontaneous abortion，RSA）和25 例正常早孕女性的生殖道菌群特征，與正常早孕女性相比，RSA 患者宮腔菌群多樣性及個體間菌群結(jié)構(gòu)相似度無顯著變化（P＞0.05），但優(yōu)勢菌種發(fā)生改變。正常早孕女性宮腔優(yōu)勢菌種以卷曲乳桿菌為主，RSA 患者宮腔優(yōu)勢菌種為惰性乳桿菌，RSA 患者宮腔菌群中兩歧雙歧桿菌和不能培養(yǎng)的不動桿菌豐度顯著減少（P＜0.05），而擬桿菌屬、大腸埃希菌/志賀菌屬和瘤胃菌屬團顯著增加（P＜0.05）。因此推測RSA 的發(fā)生與宮腔內(nèi)優(yōu)勢菌群發(fā)生改變有關(guān)。

目前有關(guān)不孕癥患者宮腔菌群的研究結(jié)果仍存在差異，這可能與受試者數(shù)量、受試人群種族、孕產(chǎn)史、生活習(xí)慣、是否合并其他婦科疾病、是否使用激素類藥物、取樣方法、取樣時間和檢測方法等有關(guān)，宮腔內(nèi)微生物群的變化可能并不能完全解釋IVF 治療成功率的差異，但宿主對宮腔菌群狀態(tài)的反應(yīng)可能導(dǎo)致不孕。因此，深入了解微生物群與宿主的相互作用可能為宮腔菌群與IVF 治療成功率間的關(guān)系提供信息。

3 宮腔共生菌群紊亂導(dǎo)致胚胎著床障礙的機制

3.1 宮腔共生菌群紊亂導(dǎo)致抗菌屏障損傷正常生理情況下，子宮內(nèi)膜共生菌群與子宮內(nèi)膜上皮細胞相互作用可形成抵御病原體的健康物理抗菌屏障，兩者相結(jié)合誘發(fā)各種抗菌肽（antimicrobial peptide）向?qū)m腔內(nèi)釋放?？咕氖且环N有效的廣譜抗菌蛋白，可破壞微生物膜影響代謝過程，其是上皮組織抵御各種病原體（包括細菌、真菌和一些病毒）蛋白水解酶的關(guān)鍵防御機制中的一部分[16-17]。此外，宮腔共生菌群還會誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細胞產(chǎn)生黏液，并穩(wěn)定子宮內(nèi)膜細胞間的黏附連接和緊密連接[18-19]，加強子宮內(nèi)膜黏膜屏障的完整性。宮腔共生菌群的定植抗性（抵抗病原體定殖的能力）能保護宿主免受感染，這可能是支持健康子宮微生物群的潛在機制。宮腔共生菌群也可能競爭細胞的受體，一項體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，生殖道中存在乳桿菌可防止淋病奈瑟菌附著于子宮內(nèi)膜細胞[20]。因此，完整且穩(wěn)定的上皮屏障是保護子宮內(nèi)膜免受機會性致病微生物感染、定植及侵入的天然防御的一部分，但是目前關(guān)于具體致病微生物破壞宮腔抗菌屏障的機制尚不完全清楚。

3.2 宮腔共生菌群紊亂導(dǎo)致免疫細胞失衡胚胎植入是一個復(fù)雜的過程。成功的胚胎植入和妊娠維持有賴于胚胎和母體子宮內(nèi)膜微環(huán)境的平衡，維持這個平衡的重要因素之一就是免疫細胞。子宮內(nèi)膜中免疫細胞的數(shù)量和功能異常，必然會影響胚胎植入的過程以及妊娠的維持。研究表明宮腔內(nèi)乳桿菌等能募集調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg 細胞），從而激活巨噬細胞，增強炎癥反應(yīng)，對早期胚胎著床起著積極作用[21]。然而宮腔內(nèi)定植的擬桿菌中含有多糖A，可引起循環(huán)系統(tǒng)中CD4+輔助性T 細胞1（T helper type 1，Th1）的增加[22]，Th1/Th2 平衡偏向Th1 可能導(dǎo)致母體免疫耐受平衡受損而影響胚胎著床。另有研究顯示，以革蘭陰性菌為主的微小病原體可突破合體滋養(yǎng)細胞進入絨毛組織產(chǎn)生內(nèi)毒素，誘導(dǎo)蛻膜中Th1 細胞比例升高，引起以Th1 主導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生增多，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6 和IL-8，激活子宮內(nèi)膜的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致母胎界面的功能受損，引起胚胎植入失敗或者自然流產(chǎn)[23]。Wang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，慢性子宮內(nèi)膜炎患者子宮內(nèi)膜Th17 表達上調(diào)，轉(zhuǎn)化生長因子α（transforming growth factor α，TGF-α）及IL-10 表達下調(diào)，提示慢性子宮內(nèi)膜炎患者子宮內(nèi)膜中Th17/Treg 細胞比例失衡引起促炎反應(yīng)，最終導(dǎo)致RSA 或RIF 等不良生殖結(jié)局，而微生物病原體是導(dǎo)致慢性子宮內(nèi)膜炎的重要病因。Chen 等[25]研究了因子宮內(nèi)膜微生物群紊亂導(dǎo)致慢性子宮內(nèi)膜炎的RIF 患者子宮內(nèi)膜免疫微環(huán)境的變化，發(fā)現(xiàn)慢性子宮內(nèi)膜炎組葉桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬的豐度顯著高于非慢性子宮內(nèi)膜炎組，這兩種菌屬與樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、子宮自然殺傷（uterine natural killer，uNK）細胞以及Treg細胞數(shù)量呈正相關(guān)，而uNK 細胞的異常分化可能通過影響子宮內(nèi)膜和（或）蛻膜細胞血管和滋養(yǎng)層的發(fā)育導(dǎo)致胚胎植入失敗。該研究還提到這2 種菌屬與巨噬細胞數(shù)量呈負相關(guān)，巨噬細胞是最常見的抗原呈遞細胞，巨噬細胞引起的特定細胞因子變化可能對胚胎著床產(chǎn)生不利影響，這可能是子宮內(nèi)膜微生物群影響子宮內(nèi)膜容受性的重要機制之一。此外，宮腔共生菌群紊亂可通過激活uNK 細胞上的殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）與絨毛外滋養(yǎng)細胞（extravillous trophoblast，EVT）上的人類白細胞抗原C（human leukocyte antigen-C，HLA-C）和HLA-G 相互作用，促進EVT 侵襲、基質(zhì)降解、血管生成以及最終的母體螺旋動脈重塑[26]。目前有關(guān)宮腔微生物與免疫細胞間的具體關(guān)系仍需進一步深入研究，免疫細胞失衡是某種特定微生物起主導(dǎo)作用還是共生菌群紊亂共同起作用以及菌群之間的協(xié)同或拮抗作用如何影響免疫細胞等問題均仍需要大量研究來證實。

3.3 宮腔共生菌群紊亂導(dǎo)致細胞因子異常正常生理情況下，宮腔內(nèi)乳桿菌通過刺激宿主吞噬細胞的吞噬能力、刺激細胞產(chǎn)生各種細胞因子如IL-10、IL-12、TNF 和干擾素（interferon，IFN）等，增強宿主的免疫能力。不孕癥患者宮腔內(nèi)以非乳桿菌為主的特征菌如加德納菌、普雷沃菌和伯克霍爾德菌等都屬于革蘭陰性桿菌，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細胞外壁的重要組成成分，可以激活宿主細胞細胞膜表面的Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4），子宮內(nèi)膜微生物菌群能與TLRs結(jié)合激活絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子κB（nuclear factorκB）信號通路并介導(dǎo)子宮內(nèi)膜發(fā)生免疫炎性反應(yīng)，導(dǎo)致大量細胞因子的表達，包括TNF-α、IL-6 和IL-1β等細胞因子的產(chǎn)生[27]。Kim 等[28]建立了三維胚胎體外種植模型，研究LPS 對滋養(yǎng)層細胞在子宮內(nèi)膜上皮細胞上附著和生長的不利影響，發(fā)現(xiàn)使用LPS 處理可顯著增加子宮內(nèi)膜細胞中細胞因子C-X-C 趨化因子配體1 [chemokine (C-X-C motif) ligand 1，CXCL1]、IL-8 和IL-33 的mRNA 表達，并降低黏附分子ITGβ3（integrin beta 3）和ITGβ5 的蛋白表達，提示LPS 通過在母胎界面誘導(dǎo)過度炎癥反應(yīng)而降低子宮內(nèi)膜容受性。此外，宮腔共生菌群紊亂可增加子宮中趨化因子CXCL1 和選擇素E 水平，維持炎癥反應(yīng)并招募B 細胞，最終導(dǎo)致慢性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生，提示子宮內(nèi)膜功能障礙可導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變和局灶性間質(zhì)破裂，也就是說，宮腔共生菌群可能通過調(diào)節(jié)基因表達、改變上皮細胞通透性以及改變促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)之間的平衡而對子宮內(nèi)膜產(chǎn)生影響[29]。由此可見，宮腔共生菌群紊亂會誘發(fā)生殖道內(nèi)宿主的免疫反應(yīng)，增加促炎性細胞因子的產(chǎn)生，這可能會損害胚胎植入，并在IVF 周期中導(dǎo)致不良的臨床結(jié)局。然而不同的宮腔微生物是否與細胞因子的改變以及妊娠的成功有關(guān)仍有待探討。

3.4 宮腔共生菌群紊亂導(dǎo)致代謝產(chǎn)物異常宮腔共生菌群與宿主之間的相互作用產(chǎn)生了多種代謝產(chǎn)物，受這些代謝產(chǎn)物影響的代謝途徑主要包括氨基酸、碳水化合物和脂質(zhì)代謝，它們與生命活動密切相關(guān)。這些活動進一步影響宿主細胞功能、免疫力和疾病易感性，并幫助維持宿主生殖道微環(huán)境的平衡。Sun 等[30]研究發(fā)現(xiàn)不孕癥患者宮腔內(nèi)卷曲乳桿菌和惰性乳桿菌的豐度顯著低于健康女性，提示這2 種細菌豐度可能與不孕癥有關(guān)，進一步分析差異細菌的代謝通路發(fā)現(xiàn)在不孕癥患者氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝以及其他次級代謝產(chǎn)物的生物合成更為活躍，異常微生物群的生物降解和代謝受到限制，不孕癥患者降解氯烯烴等外源性物質(zhì)以及通過細胞色素P450 代謝外源性物質(zhì)的能力可能降低。目前有關(guān)不孕癥患者宮腔微生物代謝產(chǎn)物的研究較少。有研究顯示腸道微生物群的代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸可以促進特定微生物生長，抑制其他細菌生長，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)[31]，另外，短鏈脂肪酸，如醋酸鹽、丁酸鹽和丙酸鹽具有改變多種細胞表觀遺傳狀態(tài)的能力[32]。在人類生殖環(huán)境中，微生物代謝產(chǎn)物可直接（如通過短鏈脂肪酸）或間接（如酸化、堿化、炎癥反應(yīng)）對局部細胞和組織的適應(yīng)產(chǎn)生影響。宮腔共生菌群紊亂產(chǎn)生異常的代謝產(chǎn)物在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。所有相關(guān)的生殖過程，包括受精、著床、胎盤形成、免疫耐受和胚胎發(fā)育等，都可能因微環(huán)境失調(diào)而發(fā)生不利的改變[33]。

4 結(jié)語與展望

通過確立健康女性宮腔正常的共生菌群將有助于判別導(dǎo)致女性生育力下降的致病菌，并進行對應(yīng)的干預(yù)，從而提高女性生育力。評估宮腔微生物群穩(wěn)定性的縱向研究有助于識別細菌是短暫定植還是穩(wěn)定存在。確定細菌的生存能力也將有助于區(qū)分微生物群是否在宮腔內(nèi)長期存在。越來越多的證據(jù)表明生殖道微生物群與女性生殖健康有關(guān)，未來的研究應(yīng)著眼于從病理生理機制方面研究宮腔微生物群的潛在功能，從而有助于發(fā)現(xiàn)疾病的發(fā)病機制。當(dāng)宮腔內(nèi)致病微生物導(dǎo)致宮腔共生菌群的結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生改變時，可能會引起抗菌屏障損傷、免疫細胞比例失衡、促炎因子釋放增多和代謝產(chǎn)物異常，從而改變宮腔微環(huán)境影響胚胎著床。然而宮腔共生菌群的特征及特定微生物在胚胎著床中的作用尚未完全明確，有待進一步研究證實，這將有助于從宮腔微生態(tài)角度探討不孕癥治療的新途徑。