調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在胰島移植中的研究進(jìn)展

李雨瀟，張梅

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210029）

1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus， T1DM）是一種由致病性CD4+、CD8+T 細(xì)胞介導(dǎo)的胰島β 細(xì)胞進(jìn)行性破壞的自身免疫性疾?。?］?；颊咝枰K身胰島素治療，盡管胰島素替代療法有助于改善糖代謝，但其不能完全替代內(nèi)源性胰島素的生物學(xué)功能，使患者面臨低血糖發(fā)作和并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)［2］。胰島移植（islet transplantation， IT）是目前根治T1DM的一種理想方式，從供體胰腺分離純化得到的胰島細(xì)胞經(jīng)門靜脈輸注到受體肝臟內(nèi)，從而建立內(nèi)源性葡萄糖依賴的胰島素分泌系統(tǒng)，恢復(fù)體內(nèi)生理性胰島素分泌模式，最終實(shí)現(xiàn)T1DM 患者長(zhǎng)期胰島素獨(dú)立性和血糖穩(wěn)定。在過去的幾十年，臨床IT 取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，特別是對(duì)于反復(fù)發(fā)生低血糖和低血糖意識(shí)障礙的患者［3］，IT 是有效方法。但I(xiàn)T 作為治療T1DM 主要挑戰(zhàn)是：胰島來源有限、需要終身免疫抑制等［4］。既往選擇免疫抑制藥物（immunosuppressive drugs， ISDs），但增加了多種不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，包括感染易感性和繼發(fā)性癌癥［5］。

調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）是一類起免疫負(fù)調(diào)控作用的細(xì)胞，維持免疫耐受。Treg 的數(shù)量和（或）功能缺陷與T1DM 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)?；赥reg 細(xì)胞的細(xì)胞療法目前正在自身免疫性疾病、移植領(lǐng)域進(jìn)行臨床試驗(yàn)。在本篇綜述中，我們將闡述Treg 在胰島移植中免疫調(diào)控作用的研究進(jìn)展。

1 胰島移植的免疫學(xué)特征

Qi 等［6］對(duì)在芝加哥Illinois 大學(xué)進(jìn)行同種異體IT 的患者隨訪了5 年，60%的患者術(shù)后5 年仍不需要外源性胰島素。然而仍有部分患者不能完全脫離外源性胰島素治療，其主要原因是由于胰島移植物的破壞及功能下降。目前認(rèn)為引起胰島功能下降的原因包括：① 同種異體排斥反應(yīng)：由于人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）的不適配，會(huì)發(fā)生急性或慢性的免疫排斥反應(yīng)。② 血液介導(dǎo)的即刻炎性反應(yīng)（instant blood-mediated inflammatory reaction， IBMIR）：目前IT 的主要手術(shù)方式是分離的胰島經(jīng)肝門靜脈注入以輸送至肝臟。由于肝臟血供豐富，與其他移植部位相比，胰島可更好地存活，但與此同時(shí)胰島細(xì)胞在沒有任何保護(hù)的情況下直接暴露于血液中，可能會(huì)誘發(fā)一種非特異性炎癥，稱為IBMIR，其特征是血小板的消耗，凝血及補(bǔ)體系統(tǒng)的激活［7］。在IT 后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，IBMIR 可上調(diào)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，包括白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ） 和 腫 瘤 壞 死 因 子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），從而促進(jìn)免疫細(xì)胞，如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，迅速聚集在移植部位，最終導(dǎo)致胰島移植物的損失［8］。一項(xiàng)多中心的Ⅱ期隨訪研究表明，低分子量硫酸葡聚糖通過阻斷凝血和補(bǔ)體激活而抑制IBMIR［9］。在小鼠胰島移植模型中證明了α-1 抗胰蛋白酶抑制了IBMIR，改善了移植效果［10］。目前采用低分子肝素鈉治療是標(biāo)準(zhǔn)方法［11］。③ 復(fù)發(fā)的自身免疫反應(yīng)：研究表明自身反應(yīng)性T 細(xì)胞具有抗原的記憶性。IT 后抗谷氨酸脫羧酶抗體、酪氨酸磷酸酶抗體水平增加，但這一現(xiàn)象對(duì)移植物存活的直接影響尚不清楚［12］。利用非肥胖糖尿?。╪on-obese diabetes，NOD）小鼠的動(dòng)物模型證實(shí)，控制對(duì)β 細(xì)胞的反復(fù)自身免疫反應(yīng)是胰島移植中最難克服的困難之一［13-14］。

2 Treg 的功能及作用機(jī)制

Treg 是一類發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用的CD4+T 細(xì)胞亞群［15］。人類Treg 只占CD4+T 細(xì)胞的一小部分（約5% ～ 7%）。根據(jù)來源不同，可分為胸腺Treg 細(xì)胞（tTreg）、外周Treg 細(xì)胞（pTreg） 和誘導(dǎo)型Treg 細(xì)胞（iTreg） 3 大類。Treg 細(xì)胞通過多種機(jī)制產(chǎn)生免疫耐受：通過CTLA-4、TGF-β 及GITR等直接與靶細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，并抑制靶細(xì)胞上IL-2Rα 鏈的表達(dá)，降低靶細(xì)胞對(duì)IL-2 的反應(yīng)性從而抑制效應(yīng)T 細(xì)胞的增殖；分泌抑制性細(xì)胞因子如IL-10、IL-35、TGF-β。近期研究表明活化后的Treg 細(xì)胞可表達(dá)顆粒酶，在細(xì)胞直接接觸的基礎(chǔ)上，通過穿孔素依賴的細(xì)胞毒作用殺傷多種自體靶細(xì)胞［16］。由于Treg 細(xì)胞可以在體外大量分離和擴(kuò)增，且不會(huì)失去其免疫調(diào)節(jié)特性，因此它們是免疫治療的潛在靶點(diǎn)。臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，Treg 過繼轉(zhuǎn)移在移植物抗宿主疾?。╝cute graftversus-host disease， GVHD）和T1DM 中是安全、有效的［17］。

3 Treg 在胰島移植中的作用

3.1 Treg 在同種異體胰島移植免疫中的作用：大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)Treg 細(xì)胞的數(shù)量與急性GVHD 的發(fā)展呈負(fù)相關(guān)。2009 年，Berney 等［18］報(bào)道了1 例患者體內(nèi)的胰島移植物存活長(zhǎng)達(dá)11 年，研究發(fā)現(xiàn)該患者體內(nèi)Treg 數(shù)量顯著高于其他胰島移植的患者，據(jù)此推測(cè)胰島細(xì)胞長(zhǎng)期存活可能與Treg數(shù)量相關(guān)。Rieger 等［19］通過免疫組化檢測(cè)腸道組織中FOXP3 的表達(dá)從而分析了浸潤(rùn)性Treg 細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果表明急性和慢性GVHD 患者的FOXP3+/CD8+T 細(xì)胞比率與健康對(duì)照組相似，但低于感染性炎癥患者或無GVHD 的同種異體移植患者，提示GVHD 與腸道GVHD 病變中Treg 細(xì)胞數(shù)量上調(diào)不足有關(guān)。Molina-Aguilar 等［20］對(duì)多次輸血發(fā)生同種異體免疫排斥反應(yīng)的患者血液進(jìn)行流式檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD4/CD8 比率降低，B 淋巴細(xì)胞增加和Treg 細(xì)胞缺乏。

目前，多項(xiàng)研究通過體外擴(kuò)增Treg 來促進(jìn)同種異體移植物的耐受。早在2002 年，Taylor 等［21］首次證明輸注體外激活和擴(kuò)增的CD4+CD25+Treg 細(xì)胞可以在GVHD的動(dòng)物疾病模型中提供實(shí)質(zhì)性的保護(hù)。然而，在動(dòng)物模型中的研究表明輸注多克隆Treg 治療所需數(shù)量大，治療作用有限且可能引起廣泛免疫抑制導(dǎo)致腫瘤和感染發(fā)生，而使用供體特異性Treg可以顯著增強(qiáng)Treg 治療的效力［22］。張梅等［23］證實(shí)向受體小鼠體內(nèi)輸注抗原特異性Treg 可以延長(zhǎng)胰島移植物的存活時(shí)間。Marek 等［24］發(fā)現(xiàn)人胰島細(xì)胞表面包被抗原特異性Treg 可以為待移植的胰島細(xì)胞提供免疫保護(hù)。Hu 等［25］對(duì)NSG 小鼠進(jìn)行了IT，聯(lián)合使用IL-2 和雷帕霉素3 周，CD4+CD25+FOXP3+Treg的擴(kuò)增明顯，CD4+T 細(xì)胞分泌的TGF-β 的增強(qiáng)，因此顯著延長(zhǎng)了同種異體移植物的生存。通常供體特異性Treg 是通過同種異體抗原遞呈細(xì)胞長(zhǎng)期體外刺激而產(chǎn)生的［22］，然而這種方法在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性。

近年來，嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）技術(shù)成功地用于產(chǎn)生抗原特異性Treg，克服了基于體外抗原刺激的方案的局限性。已有多項(xiàng)研究將供者來源的以HLA 為靶點(diǎn)的CAR-Treg 輸注，結(jié)果提示供體特異性抗HLA-A2 CAR-Treg 顯著減輕了同種異體皮膚移植、心臟移植引起的GVHD［26-27］。2021 年，Muller 等［28］通 過CRISPR/Cas9 技 術(shù) 敲除內(nèi)源性T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）并使用慢病毒轉(zhuǎn)入A2-CAR，產(chǎn)生的A2-CAR+TCR-的人Treg 細(xì)胞在體外保持了Treg 的表型和功能。無論是從HLA-A2 轉(zhuǎn)基因小鼠還是從人類供體移植胰島，抗HLA-A2 CAR-Treg 都選擇性地聚集在表達(dá)HLA-A2 的胰島上并且不會(huì)損傷胰島的功能。這有助于開發(fā)針對(duì)移植耐受的更精密Treg 細(xì)胞療法。

3.2 Treg 在胰島移植后自身免疫中的作用：復(fù)發(fā)性自身免疫性糖尿病最初在同卵雙胞胎的IT 中證實(shí)。移植后糖尿病逆轉(zhuǎn)，但6 ～ 12 周后移植物功能受損，胰島β 細(xì)胞被破壞，導(dǎo)致糖尿病復(fù)發(fā)［29］，抑制自身免疫性復(fù)發(fā)對(duì)于T1DM 患者的成功胰島移植至關(guān)重要。Zhang 等［30］發(fā)現(xiàn)HMGB1，一種進(jìn)化上保守的染色體蛋白質(zhì)，通過損害Treg 的穩(wěn)定性來加劇自身免疫進(jìn)展和IT 后自身免疫的復(fù)發(fā)。Lin 等［31］從接受IT 的NOD 鼠中分選CD4+T 細(xì)胞并用丙戊酸（valproic acid，VPA）的處理后，Treg細(xì)胞的百分比和絕對(duì)數(shù)量以劑量依賴性方式顯著增加，從而抑制自身免疫的復(fù)發(fā)，為細(xì)胞治療提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。與此類似的是，Huang 等［32］發(fā)現(xiàn)用α 硫辛酸（alpha lipoic acid，ALA）處理受體脾臟和胰腺淋巴結(jié)后抑制Th1 細(xì)胞免疫反應(yīng)并誘導(dǎo)Treg 的分化，從而抑制了NOD 小鼠的自發(fā)性糖尿病和IT 后的自身免疫性復(fù)發(fā)?；谝陨涎芯浚砻鱐reg 在IT 后復(fù)發(fā)自身免疫可能發(fā)揮重要作用。

4 總 結(jié)

T1DM 的特征是胰島素絕對(duì)缺乏［33-34］，外源性胰島素治療無法從根本上解決胰島功能的損傷。因此，IT 越來越受矚目，其可通過植入具有正常功能的胰島細(xì)胞以替代患者體內(nèi)功能受損的胰島細(xì)胞，從而恢復(fù)患者血糖調(diào)節(jié)能力，維持正常血糖水平，以期避免并發(fā)癥的發(fā)生。然而自身免疫反應(yīng)、同種異體排斥反應(yīng)對(duì)胰島移植物的破壞，是其應(yīng)用于臨床的巨大挑戰(zhàn)。Treg 是一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞，可以誘導(dǎo)移植免疫耐受和（或）免疫調(diào)控自身免疫性疾病。在過去的幾十年里，T1DM和IT 的基礎(chǔ)及臨床研究結(jié)果顯示，基于Treg 的療法是有效的、安全的。通過同種異體抗原刺激體外擴(kuò)增的抗原特異性Treg，在防止器官和組織移植排斥反應(yīng)方面比多克隆Treg 更有效［35］。隨著技術(shù)的發(fā)展，CAR-Treg 已經(jīng)被證明在移植領(lǐng)域具有可行性，為利用這種方法在IT 領(lǐng)域的治療奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突。