鞣花酸pH敏感載藥微球的釋放規(guī)律研究

徐佳敏，蔣新元，伍佑輝，倪丹，賀靖雁

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 理學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；3.湖南省木本生物質(zhì)轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004)

鞣花酸(EA)是一種植物多酚類物質(zhì)，存在于各種植物果實如石榴中，具有抗癌變、抗病毒等作用[1-5]。但鞣花酸水溶性差，且口服鞣花酸的半衰期短，生物利用度低[6]，限制了其應(yīng)用。天然高分子材料具有良好的生物可降解性、生物相容性及生物安全性，在生物醫(yī)學(xué)材料尤其是藥物釋放方面得到廣泛應(yīng)用[7-8]。本文通過選擇合適的方法以提高鞣花酸的分散性，以天然高分子材料為基材制備了能包覆并緩釋鞣花酸的復(fù)合微球，并研究和模擬了不同pH條件下和不同介質(zhì)溶液中鞣花酸復(fù)合微球包覆體系中鞣花酸的釋放規(guī)律，以充分發(fā)揮其定向抗氧化、殺菌及抗癌等效果。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

鞣花酸(純度98%)；PBS緩沖溶液，飛凈生物科技有限公司；胰蛋白酶(1∶250)，上海百舜生物科技有限公司；胃蛋白酶(1∶1 000)，廣州賽國生物；濃鹽酸、戊二醛、無水氯化鈣、天然高分子材料A、天然高分子材料B 均為分析純。

TM-1810型紫外可見分光光度計；AUY120電子分析天平；JJ-1A精密電動攪拌器；PHS-25 pH計；蔡司sigma 300場發(fā)射掃描電鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 鞣花酸分散體系的制備 根據(jù)文獻[9]制得鞣花酸濃度為4.0 g/L的鞣花酸分散體系，體系呈乳白色。

1.2.2 人工胃液、人工腸液的制備 取濃鹽酸 234 mL 稀釋至1 000 mL，得9.5%～10.5%的稀鹽酸。精密吸取稀鹽酸16.4 mL于1 000 mL容量瓶中，加蒸餾水約800 mL，胃蛋白酶10 g，充分搖勻后加蒸餾水定容，即得人工胃液[10]。取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使其溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8；另外稱取10 g胰蛋白酶加適量水溶解，將兩液混合后，加蒸餾水定容至 1 000 mL，即得人工腸液[10]。

1.2.3 鞣花酸微球的制備 精確稱取適量天然高分子材料A，與25 mL鞣花酸分散體系混合，電磁攪拌器充分?jǐn)嚢柚频没鞈乙?。另取醋酸與無水氯化鈣攪拌溶解為一定濃度溶液。在60 ℃水浴中，用醫(yī)用注射針頭將天然高分子材料B混懸液緩慢滴加到氯化鈣溶液中，并于600 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌一段時間后停止加熱，加100 mL與水浴溫度相同的蒸餾水，冷卻至室溫后加戊二醛固化1 h，抽濾，水洗3遍后再抽濾，放入烘箱中烘干，即得鞣花酸復(fù)合微球，備用。

1.2.4 鞣花酸微球的形態(tài)觀察 用場發(fā)射掃描電鏡觀察微球表面形貌。將真空干燥后的鞣花酸復(fù)合微球真空噴金，置于樣品平臺上觀察形貌。微球在不同pH介質(zhì)溶液中形態(tài)的變化采用相機拍攝(像素：3 024×3 024)。

1.2.5 鞣花酸微球的載藥量和包封率的測定 稱取干燥的鞣花酸復(fù)合微球于研缽中研磨成粉末，精密稱取10 mg，置于100 mL蒸餾水中浸泡30 min后超聲，使鞣花酸充分分散。以空白微球為參比，在398 nm處用紫外可見分光光度計測量吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算鞣花酸的濃度，按下式計算微球的載藥量和包封率。微球中的藥物含量為m(g)，微球質(zhì)量為M(g)，投入的藥物量為M0(g)。

載藥量=m/M×100%

包封率=m/M0×100%

1.2.6 鞣花酸微球的釋藥性能的測定 精確稱取0.10 g完全烘干的微球，分別置于100 mL的pH=2.13水溶液、pH=4.02水溶液、pH=6.86水溶液(均為稀鹽酸調(diào)節(jié))和pH=4.00緩沖溶液(鄰苯二甲酸氫鉀)、pH=6.86緩沖溶液(混合磷酸鹽)、PBS緩沖溶液(pH=7.4)，及人工胃液(pH=1.70)、人工腸液(pH=6.95)中進行靜態(tài)釋放規(guī)律的研究，恒定溫度為(37±0.5)℃。分別于0.5，1，2，4，8，15，24 h后分別取樣5 mL，同時補充相同體積的釋放介質(zhì)。測定樣品溶液的吸光度，根據(jù)不同pH下鞣花酸分散體系的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，測定各時間點的鞣花酸濃度，再計算鞣花酸在各時間點的累積釋放量。

2 結(jié)果與討論

2.1 鞣花酸微球的SEM掃描圖

圖1為不同放大倍數(shù)的鞣花酸復(fù)合微球SEM形貌。

圖1 鞣花酸微球的電鏡掃描圖

由圖1可知，鞣花酸復(fù)合微球呈球形。表面褶皺較多，不平整，可能是微球中含有少量氣泡，或者干燥時急速皺縮造成的。

2.2 微球的載藥性能及在不同pH介質(zhì)溶液中的釋放規(guī)律

2.2.1 不同pH介質(zhì)溶液中鞣花酸分散體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取鞣花酸分散體系0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 mL于100 mL容量瓶中，分別用相應(yīng)溶液定容，搖勻。以相應(yīng)的試劑為空白對照，利用紫外吸收分光光度法測量。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到鞣花酸分散體系在不同pH介質(zhì)中的回歸方程，結(jié)果見表1(Y表示吸光度，C表示濃度)。表明鞣花酸分散體系在0.002～0.024 g/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 鞣花酸分散體系在不同pH介質(zhì)中的回歸方程

2.2.2 鞣花酸微球的載藥性能 根據(jù)《中國藥典》規(guī)定[10]，微球、微囊與脂質(zhì)體需提供載藥量的數(shù)據(jù)，而分散在液體介質(zhì)中的微囊、微球與脂質(zhì)體應(yīng)用適當(dāng)方法分離后測定計算包封率，且包封率不得小于80%。本實驗中，將10 mg研磨粉碎的鞣花酸微球完全溶解在100 mL蒸餾水中，利用紫外吸收分光光度計檢測其吸光度，根據(jù)2.2.1節(jié)中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線從而計算出鞣花酸的含量，得到鞣花酸微球的載藥量為14.36%，包封率為86.16%，體現(xiàn)了微球質(zhì)量較好，制備工藝可行。

2.2.3 鞣花酸微球在不同pH介質(zhì)溶液中的釋放規(guī)律 實驗研究了所制備的鞣花酸微球在不同pH水溶液、不同pH緩沖溶液及模擬人工胃液和人工腸液的釋放規(guī)律。圖2為鞣花酸微球在pH 2.13，4.02，6.86水溶液中的釋放曲線。

圖2 鞣花酸微球在不同pH水溶液中的釋放曲線

由圖2可知，微球在pH=2.13和pH=4.02水溶液中釋放的較為緩慢，起始0.5 h時，累計釋放率分別為0.31%和0.56%，8 h時分別為0.85%和 2.14%，當(dāng)釋放時間達(dá)到24 h時，累計釋放率分別僅為0.98%，2.67%，表明鞣花酸微球在酸性條件下累計釋放率低。而微球在偏中性條件的pH=6.86 水溶液中累計釋放率較酸性條件下稍高，整體趨勢為先釋放得快，后逐漸減慢，在0.5 h時，微球在蒸餾水中的累計釋放率為2.78%，8 h時增加至7.34%，而在24 h時則達(dá)到10.79%，明顯高于在pH=2.13和pH=4.02水溶液中的釋放，說明微球中鞣花酸的釋放率隨介質(zhì)溶液pH的升高而增大。

圖3為鞣花酸微球在pH=4.00緩沖溶液、pH=6.86緩沖溶液和PBS緩沖溶液(pH=7.4)中的釋放曲線。

圖3 鞣花酸微球在不同pH緩沖溶液中的釋放曲線

由圖3可知，起始0.5 h時，微球在3種緩沖溶液中的累計釋放率分別為 0.59%，2.06%和1.92%，鞣花酸復(fù)合微球在pH=4.00的緩沖溶液中累計釋放率較低，而微球在pH=6.86緩沖溶液中的釋放稍快，0.5～1 h中微球在PBS緩沖溶液(pH=7.4)中累計釋放率陡然變大，后緩慢增加，24 h 時微球在三種緩沖溶液中的累計釋放率分別為1.35%，21.74%和36.73%，說明當(dāng)介質(zhì)溶液pH值偏中性和堿性時，微球中鞣花酸能得到一定程度的釋放。

圖4為鞣花酸微球在人工胃液、人工腸液中的釋放曲線。

圖4 鞣花酸微球在人工胃腸液中的釋放曲線

由圖4可知，鞣花酸微球在人工腸液中的釋放遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在人工胃液中。起始0.5 h微球在人工胃液、人工腸液中的累計釋放率分別僅為0.18%和 6.04%，8 h時微球在人工胃液和人工腸液中的累計釋放率分別達(dá)到6.91%和50.18%，至24 h時在人工胃液和人工腸液中的累計釋放率則分別達(dá)到13.92%和90.45%，24 h時在人工腸液中微球鞣花酸的釋放遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在人工胃液中的釋放，且差不多達(dá)到完全的釋放，通過復(fù)合微球?qū)坊ㄋ岬母捷d，可實現(xiàn)鞣花酸在腸液中緩慢而充分的定向釋放。

2.2.4 鞣花酸微球在不同pH介質(zhì)中的形態(tài)變化 圖5為鞣花酸微球在部分介質(zhì)中的形態(tài)變化，圖中A1、B1、C1為鞣花酸微球的起始狀態(tài)，圖中A2、A3、B2、B3、C2、C3為鞣花酸微球分別在pH=6.86緩沖溶液、PBS緩沖溶液和人工腸液中4 h和24 h時的形態(tài)變化。

圖5 鞣花酸微球在不同pH介質(zhì)中的形態(tài)變化

由圖5可知，鞣花酸微球在pH=6.86緩沖溶液中隨時間延長體積逐漸膨脹并發(fā)生少量溶解導(dǎo)致鞣花酸分散體系的少量釋放，24 h時溶液輕微渾濁且底部仍有大部分未完全溶解的微球；在偏堿性的PBS緩沖液中微球體積隨時間的延長沒有明顯膨脹，但顏色逐漸變黃，且球形結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，可能是PBS緩沖液的堿性條件對微球中鞣花酸顏色的影響；鞣花酸微球在人工腸液中隨著時間延長逐漸膨脹，24 h時溶液中已無微球存在，僅剩少量殘渣，且溶液明顯變渾濁，可能是人工腸液中的胰蛋白酶破壞了鞣花酸微球的凝膠外殼，從而使鞣花酸分散體系能得到充分的釋放。

3 結(jié)論

以天然高分子材料為基材制備的鞣花酸復(fù)合微球球形度較好，對濃度為4 g/L的鞣花酸分散體系的載藥量為14.36%，包封率為86.16%。鞣花酸復(fù)合微球在pH=2.13水溶液、pH=4.02水溶液和pH=6.86水溶液中24 h累計釋放率分別為0.98%，2.67%和10.79%，在pH=4.00緩沖溶液、pH=6.86 緩沖溶液和PBS緩沖溶液(pH=7.4)的24 h累計釋放率分別為1.35%，21.74%和36.73%，在人工胃液和人工腸液中24 h累計釋放率分別為 13.92% 和90.45%。鞣花酸復(fù)合微球在較強酸性介質(zhì)溶液中隨時間延長形狀無明顯變化，在弱酸性溶液中鞣花酸微球則逐漸膨脹并發(fā)生少量溶解及釋放，在偏堿性溶液中微球未發(fā)生明顯膨脹，但顏色逐漸變黃，且球形結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，而鞣花酸微球在人工腸液中隨時間延長逐漸膨脹，到24 h時微球基本上被完全破壞，鞣花酸分散體系幾乎得到完全釋放，說明該微球具有較好的pH敏感特性。