纖維素在固定化酶的研究進展

徐效，熊艷舒，黃可榆，謝彩鋒，2，3，4，杭方學，2，3，4，陸海勤，3，4，李凱，2，3，4

(1.廣西大學 輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，廣西 南寧 530004；3.蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530004；4.廣西綠色制糖工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530004)

酶作為一種生物催化劑，可在不改變化學平衡情況下提高反應(yīng)速度，具有生物相容性、生物降解性[1]。近年來，酶因具有高效率、特異性強、反應(yīng)條件溫和低能耗等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究[2]和工業(yè)生產(chǎn)(食品、制藥、化妝品、紡織、造紙等多個領(lǐng)域[3-7])。隨著生物技術(shù)發(fā)展，酶在工業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)地位日益重要，但穩(wěn)定性差、回收率低、成本高及產(chǎn)量小等難題始終限制著游離酶在工業(yè)中大規(guī)模應(yīng)用，為此，酶固定化技術(shù)應(yīng)運而生。

酶固定化技術(shù)最早出現(xiàn)于1916年[8]。酶固定化技術(shù)是指選擇適當?shù)墓潭ɑ椒▽⒂坞x酶固定在便于回收的載體上的一種生物技術(shù)，能夠使酶重復(fù)使用延長酶使用壽命，提高酶穩(wěn)定性，進而明顯降低生產(chǎn)成本，顯著拓寬了酶應(yīng)用領(lǐng)域。近幾十年來，固定化材料和酶工程領(lǐng)域的發(fā)展得到學者與生產(chǎn)企業(yè)廣泛關(guān)注，取得長足進步。目前酶的固定化方法主要通過物理(吸附、包埋)和化學相互作用(交聯(lián)、共價鍵)來實現(xiàn)，載體表面結(jié)構(gòu)、疏水/親水性、物理化學穩(wěn)定性、活性基團等特性及適合于不同酶制劑的固定化技術(shù)的選擇會影響固定化酶的強度和穩(wěn)定性。因此，良好的固定化酶載體和先進的固定化酶技術(shù)是提高固定化酶品質(zhì)的關(guān)鍵[9]。

纖維素是地球上最豐富的天然聚合物之一，廣泛存在自然界植物中，也可由藻類、被囊動物或特定細菌合成[10]。纖維素因其表面具有豐富的羥基等活性基團，能夠很好地與酶結(jié)合，因此可作為一種新型的固定化酶載體；另外因為纖維素材料來源豐富，可再生，成本低，并具有良好的生物降解性[11]，作為酶固定化材料應(yīng)用具有廣泛發(fā)展前景。

1 酶的固定化載體

在工業(yè)生產(chǎn)中，大多數(shù)酶源自微生物，生物技術(shù)的發(fā)展使得酶在精細化學、食品、塑料、化妝品、藥物和生物燃料等領(lǐng)域應(yīng)用已逐漸走向商業(yè)化[12-13]。游離酶雖然反應(yīng)條件溫和，能夠提高反應(yīng)效率，但是由于其在實際應(yīng)用過程中不易從反應(yīng)介質(zhì)中分離影響產(chǎn)品品質(zhì)，導(dǎo)致工業(yè)生產(chǎn)成本過高，嚴重限制其商業(yè)化應(yīng)用。而固定化酶技術(shù)不僅能夠延長酶使用壽命，還可以降低酶的使用成本，為工業(yè)酶的研究打開了一條新路徑。在固定化酶技術(shù)中，固定化載體的研究至關(guān)重要。固定化酶載體本身的穩(wěn)定性和機械強度會影響酶的可回收性，另外，載體的比表面積大小、多孔結(jié)構(gòu)以及表面活性官能團與酶的負載量有著密切聯(lián)系。因此，固定化酶載體對最終形成固定化酶物化特性影響重大。固定化酶載體主要分為無機載體、合成聚合物載體及天然聚合物載體[14-17]。

1.1 無機載體

目前，用于固定化酶的無機載體材料主要包括二氧化硅、多孔玻璃、氧化鋁、硅藻土等[18]，二氧化硅材料因其比表面積和孔徑可控、制備簡單最受關(guān)注。典型的二氧化硅載體主要有介孔二氧化硅、硅膠、泡狀和氣相二氧化硅[19]，其中介孔二氧化硅載體固定化酶應(yīng)用最廣泛[20]。

1.2 合成聚合物載體

合成聚合物載體具有多種化學基團和機械形態(tài)，可以根據(jù)酶的特性進行組合加工。常見的合成聚合物載體包括聚氯乙烯、聚氨酯微粒、聚乙烯醇和聚苯胺等[21]。環(huán)氧甲基丙烯酸酯作為一種工業(yè)生產(chǎn)常見環(huán)氧活化樹脂，具有良好機械強度，使用該材料固定酶可用于攪拌槽或流化床反應(yīng)器[22]。

1.3 天然聚合物載體

天然聚合物載體是指從自然界獲得的聚合物，具有無毒、可生物降解、可再生等特性[23]。大多數(shù)無機及合成聚合物因可降解性差，易對環(huán)境造成污染，在倡導(dǎo)綠色環(huán)保的今天，天然聚合物作為固定化酶載體越來越備受關(guān)注。如今用于酶固定化天然聚合物載體主要有海藻酸鈉、殼聚糖、瓊脂糖、纖維素等。海藻酸鈉和殼聚糖是酶包埋中最常用的載體，酶的包埋率可以達到90%以上，且在不同pH及溫度條件下具有良好穩(wěn)定性；但這兩種載體其孔徑大小較難控制，酶與底物不易接觸使反應(yīng)不充分；另外，這兩類載體機械強度較小，在實際應(yīng)用過程中載體容易破碎，使酶泄露出來[24-25]。瓊脂糖具有親水性、孔隙率高、機械強度大以及穩(wěn)定性好等特點，用其來對酶進行固定，每克濕載體負載量最高可以達到100 mg；但瓊脂糖作為固定化酶的載體材料成本過高，不適合工業(yè)化推廣[26]。纖維素載體比表面積大、機械強度高的特性使酶能夠更多地附著其表面與底物充分接觸、多次重復(fù)使用，而且該載體材料來源廣泛可再生是現(xiàn)如今研究領(lǐng)域關(guān)注的重點，纖維素作為固定化酶的載體材料是很有發(fā)展?jié)摿Φ摹?/p>

2 纖維素載體的研究

纖維素固定化載體根據(jù)來源不同可分為木質(zhì)纖維素載體與細菌纖維素載體。纖維素載體不僅活性基團多，而且還具有機械強度大、對酶溫和等特點[27]，同時更容易從環(huán)境中獲取，價格低廉。但在特定條件下纖維素表面羥基呈弱疏水性，其在某些領(lǐng)域工業(yè)應(yīng)用受到限制，因此有研究者通過將纖維素表面羥基羧甲基化、乙酰化和硅烷化改性，開發(fā)出功能化纖維素載體[28]，或?qū)⒗w維素與其他新型材料復(fù)合，以改善纖維素固定化載體性能，拓展其應(yīng)用范圍。

2.1 木質(zhì)纖維素載體

木質(zhì)纖維素載體主要來源于木本植物、草類、農(nóng)業(yè)廢棄物，這些原料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，不同原料各組分比例有所不同[29]。由于木質(zhì)纖維素通常被半纖維素和木質(zhì)素緊密包裹，一般采用堿法化學制漿、漂白、酶解和TEMPO氧化等工藝對木質(zhì)纖維素原料進行預(yù)處理，通過溶解木質(zhì)素和半纖維素來分離出纖維素，并制備木質(zhì)纖維素載體[30]。同時，經(jīng)分離提純處理后，纖維素載體表面會暴露更多的活性基團，可以與酶更好結(jié)合，因此固定化效果更好。Bezerra等[31]將椰子皮經(jīng)堿法預(yù)處理獲得纖維素，通過乙二醛交聯(lián)固定化漆酶，固定化酶可保留初始活性的59%左右，熱穩(wěn)定性也有所提高。然而，使用木質(zhì)纖維素作為固定化酶載體存在著纖維素提純效率低、操作過程復(fù)雜等弊端。

近年來，以農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的木質(zhì)纖維素原料為載體的酶固定化技術(shù)已成為國內(nèi)外研究熱點。Priyanka等[32]以椰子纖維為載體交聯(lián)固定化漆酶，提高了漆酶穩(wěn)定性同時將酶的相對酶活提高至80%；Nuraliyah等[33]利用戊二醛(GA)使玉米殼纖維素交聯(lián)固定化脂肪酶，提高脂肪酶操作穩(wěn)定性；另外，通過對木質(zhì)纖維素進行功能化改性可提高固定化酶穩(wěn)定性，使固定化酶能夠重復(fù)多次使用以降低成本。Luo等[34]通過環(huán)氧氯丙烷的氯基團和纖維素的羥基之間的親核反應(yīng)將環(huán)氧基團引入纖維素，然后將青霉素G酰化酶(PGA)附著在環(huán)氧氯丙烷活化的纖維素微球上，固定化PGA表現(xiàn)出高效的催化活性以及熱穩(wěn)定性。Cespugli等[35]通過高碘酸鹽氧化改性稻殼纖維素使其具有官能化醛基，用于固定化脂肪酶，與未經(jīng)氧化改性的載體相比，改性后的酶負載量可提高至58%。陳輝等[36]在離子液體中用L-絲氨酸對提取菠蘿皮渣纖維素進行均相改性，并用于固定化菠蘿蛋白酶，與游離酶相比，固定化菠蘿蛋白酶具有更優(yōu)的溫度及酸環(huán)境穩(wěn)定性。研究與實踐表明，木質(zhì)纖維素材料作為固定化酶載體有許多優(yōu)勢：較大的比表面積可以提高酶負載量；材料表面的多孔結(jié)構(gòu)可使酶的構(gòu)象不易受損；纖維素表面豐富的活性基團可以通過離子交換、表面吸附、配位、絡(luò)合等復(fù)雜機理與酶相連接。這些優(yōu)勢極大提高了載體負載酶的穩(wěn)定性從而使固定化酶在反應(yīng)介質(zhì)中循環(huán)多次使用。

2.2 細菌纖維素載體

細菌纖維素(BC)是一種僅由葡萄糖單元和水組成生物材料，可以由微生物細胞在納米尺度上合成[37]。BC不含有木質(zhì)素和半纖維素等雜質(zhì)，結(jié)晶度更高，是以高純度的形式生產(chǎn)，不需要復(fù)雜繁瑣的預(yù)處理過程[38]。

相對于木質(zhì)纖維素，BC具有高結(jié)晶度和高含水量的特點，熱穩(wěn)定性更高；另外 BC還具有納米孔結(jié)構(gòu)、比表面積大、游離羥基多等優(yōu)點，因此BC被認為是新型的固定化酶載體。吳月紅等[39]采用細菌纖維素(BC)膜來固定化漆酶后，與游離酶相比，固定化漆酶對活性艷藍KN-R脫色率提高了2倍，反應(yīng)速率提高了3倍。Dikshit等[40]利用木糖桿菌從生物柴油的粗甘油中生產(chǎn)細菌纖維素(BC)并固定化脂肪酶，該固定化酶在不同溫度下都具有較高的活性、pH范圍更廣泛，與游離脂肪酶相比，BC固定化脂肪酶具有較好穩(wěn)定性和生物活性，可用于工業(yè)生產(chǎn)。Yu等[41]用APTES對BC進行了硅烷衍生物改性制備氨基官能化細菌纖維素，并用該載體固定辣根過氧化物酶(HRP)，相對活性為90%，高于游離酶，且經(jīng)過10個反應(yīng)周期相對酶活仍保持在70%以上。

2.3 纖維素復(fù)合材料

單一纖維素材料作為固定化酶載體存在不足，在工業(yè)生產(chǎn)過程中穩(wěn)定性不高且不易與反應(yīng)物分離，傳統(tǒng)分離技術(shù)(離心或納濾)會增加回收成本，為解決這些問題，科研工作者們對纖維素復(fù)合材料進行了重點研究。

Dai等[42]將菠蘿皮羧甲基纖維素、聚乙烯醇及介孔二氧化硅SBA-15水凝膠制成的復(fù)合材料用于固定化木瓜蛋白酶，與采用單一菠蘿皮羧甲基纖維素固定化木瓜蛋白酶相比，多種材料的復(fù)合使載體為酶提供了更多的附著位點，提高了酶的負載量，并且在80 ℃孵育2 h后，固定化木瓜蛋白酶活性保留56%，游離木瓜蛋白酶活性僅保留16%。儲存10 d后，固定化木瓜蛋白酶的初始活性保留79%，而游離木瓜蛋白酶的初始活性僅保留27%，固定化木瓜蛋白酶的熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性均有所提高。

另外，磁性材料作為固定化酶載體具有潛在應(yīng)用前景，將其與纖維素一起制備復(fù)合材料可以解決工業(yè)生產(chǎn)中分離成本過高問題。Drozd等[43]將細菌纖維素(從木糖科桿菌中獲得)氧化接枝聚乙烯亞胺，將與Fe2+和Fe3+混合合成的磁性細菌纖維素復(fù)合材料用于固定化脂肪酶，該固定化酶重復(fù)使用10次后相對酶活可達到65%，可通過外界磁場迅速將酶與反應(yīng)介質(zhì)分離。Suo等[44]制備了離子液體修飾的磁性羧甲基纖維素納米材料，并將其作為載體進行脂肪酶的固定化，其活性分別比游離脂肪酶和經(jīng)羧甲基纖維素納米材料固定的脂肪酶高1.43倍和2.81倍，酶的穩(wěn)定性提高顯著。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，磁性纖維素復(fù)合材料是一種固定化酶多功能載體，既具有磁性材料特性(如高比表面積及易分離)，又可與纖維素復(fù)合進行化學改性添加活性基團，更加適用于各式各樣工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境。

3 結(jié)論與展望

本文介紹了纖維素作為固定化酶載體的研究進展。雖然單一纖維素材料作為固定化酶載體在實際應(yīng)用中穩(wěn)定性不高、不易分離、回收率效率低，但將纖維素改性或與其他材料復(fù)合可以極大提高固定化酶的穩(wěn)定性和回收效率。因此，纖維素作為一種綠色環(huán)保的可再生資源用作固定化酶載體具有重要的研究價值。