不同溫度處理對煙熏鱘魚片品質的影響

廖杰，陳康，宋恭帥，薛靜，張卓濰，沈清*

（1.浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2.浙江華才檢測技術有限公司，浙江 紹興 312000）

鱘魚是世界最大的淡水魚類之一。2016年中國鱘魚養(yǎng)殖量達到了89 773噸，約占世界總產(chǎn)量的80%，已成為全球鱘魚產(chǎn)量最大的國家之一[1]。近年來鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展主要受鱘魚籽醬產(chǎn)業(yè)的推動。鱘魚籽醬素有“黑色黃金”的美譽，是將鱘魚卵經(jīng)篩選、鹽漬后制得的昂貴水產(chǎn)品，也是鱘魚加工的主要產(chǎn)品[2]。目前鱘魚肉主要用于冷凍出口和餐館鮮銷，然而凍藏鱘魚肉在解凍后品質劣化嚴重，而鮮銷鱘魚肉存在著易腐敗、貯藏期過短的問題。鱘魚肉具有較高的營養(yǎng)價值，必需氨基酸與總氨基酸的比值較優(yōu)，其多不飽和脂肪酸占總脂比例高，礦物元素含量豐富，各種營養(yǎng)素組成均衡[3]。因此，利用鱘魚肉開發(fā)具有高經(jīng)濟效益的水產(chǎn)食品是目前水產(chǎn)品加工研究熱點之一。

煙熏是一種歷史悠久的肉類食品加工保藏方法，魚類、肉類等易腐食物的煙熏處理由起初的食品貯藏和保鮮目的轉為現(xiàn)在的以獲得煙熏特有的色、香、味為主要目的，通過煙熏改變食品的口味、提高品質并延長保質期。煙熏的方法和技術參數(shù)對產(chǎn)品的品質有較大影響[4]。目前最常見的煙熏技術主要是氣態(tài)煙熏和液體煙熏。一般氣熏法熏制的產(chǎn)品在風味和顏色上都很獨特，也很耐儲藏，整體感觀品質優(yōu)于液熏法熏制的產(chǎn)品，但是肌肉蛋白質會因溫度變性，脂肪氧化溶解，品質發(fā)生變化。此外，傳統(tǒng)熏制的食品通常都含有以3，4-苯并芘為代表的多環(huán)芳烴類致癌物質[5]。因此，有效控制煙熏過程中多環(huán)芳烴類物質的產(chǎn)生，提高煙熏鱘魚的品質，具有顯著的經(jīng)濟效益和開發(fā)前景。

本試驗研究不同煙熏溫度對鱘魚片的感官、鮮度、損失率等的影響，并以菌落總數(shù)為指標采用加速試驗計算煙熏鱘魚保質期，以期為煙熏技術在鱘魚加工中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鱘魚：新昌縣鱘鰉生物科技有限公司。冷藏運至實驗室，魚片從生產(chǎn)到實驗室不超過4 h。

食品調味料：市售；硼酸、鹽酸、溴甲酚綠、正己烷、甲基紅、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、三氯甲烷（trichlooacetic acid，TCA）、2-硫代巴比妥酸 （thiobarbituric acid，TBA）、1，1，3，3-四乙氧基丙烷（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；苯并芘（benzopyrene，BaP）標準品（純度≥96%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；生理鹽水、瓊脂培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿：杭州邦沃森生物科技有限公司；0.22 μm有機膜：天津膜天膜科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

K-370自動凱氏定氮儀：瑞士BUCHI公司；SX2型高溫電爐：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；RC-6 Plus高速冷凍離心機：美國熱電儀器公司；RYX-25型煙熏爐：嘉興市瑞邦機械工程有限公司；HGC-36氮吹儀：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；SK7200LHC超聲波清洗器：上?？茖С晝x器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將鱘魚肉解凍切成5 cm×4 cm×1 cm的魚片，放入腌制液（鹽 80 g、糖 6 g、姜 6 g、味精 6 g、料酒 18 g配成1 L溶液）中腌制60 min，于室溫20℃條件下瀝干30 min，蒸汽熟化5 min，50℃干燥30 min。分別于40、60、80℃下煙熏時間30 min條件下進行熏制。

1.3.2 感官評分

感官評定方法參考Song等[6]的方法。感官評定小組由30人組成，評定前經(jīng)專業(yè)培訓，合格后于品評室內對煙熏鱘魚進行感官評定。為減少評分時主觀因素對評定人員的影響，采用3位隨機數(shù)字對樣品編號，評定時人員間互不交流，單獨進行，每個樣品評定前清水漱口后再評定下一個樣品。采用百分制標準，煙熏鱘魚感官評價標準見表1。

表1 煙熏鱘魚感官評價Table 1 The sensory score of smoked sturgeon fillets

1.3.3 煙熏損失率

煙熏過程中的鱘魚片質量損失率采用如下公式計算。

式中：SL為煙熏損失率；Ws1為鱘魚片煙熏前質量，g；Ws2為煙熏后質量，g。

1.3.4 硫代巴比妥酸反應物值的測定

稱取煙熏鱘魚肉5.00 g，加入25 mL7.5 g/100 mL的三氯乙酸溶液（含0.1 g/100 mL EDTA-2Na），振蕩搖勻30 min后經(jīng)雙層濾紙過濾，取5 mL上清液加入至5 mL濃度為0.02 mol/L的TBA溶液中，沸水浴40 min后冷卻至室溫20℃，繼續(xù)加入5 mL三氯甲烷后振蕩搖勻，待溶液分層后于532 nm波長下測定上清液的吸光度和標準系列溶液的吸光度值，并計算得出硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值[7]。TBARS值用丙二醛含量表示，按以下公式計算：

式中：x為丙二醛含量，mg/kg；c為試樣溶液中丙二醛濃度，μg/mL；V為樣品溶液體積，mL；m為最終試樣溶液所代表的試樣質量，g。

1.3.5 揮發(fā)性鹽基氮值的測定

揮發(fā)性鹽基氮參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的方法，使用自動凱氏定氮法進行測定。

1.3.6 苯并芘含量測定

稱取樣品5.00 g，經(jīng)研磨后轉移至150 mL具塞錐形瓶，加入30 mL2 mol/L的KOH溶液后塞緊瓶塞后置于70℃恒溫水浴鍋2 h；向其加入30 mL正己烷并經(jīng)100 Hz超聲輔助提取30 min；加入30 mL水并充分振蕩，靜置待正己烷相與水相分離。收集上層有機相15mL，氮氣吹干后加入1 mL乙腈溶劑復溶。樣品過0.22 μm有機膜過濾后進高效液相色譜串聯(lián)質譜（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）測定。目標化合物通過比對標準品的保留時間和質量數(shù)（m/z）確定，對樣品色譜峰積分并通過標準曲線換算得到煙熏鱘魚片中苯并芘含量[8-9]。

1.3.7 菌落總數(shù)測定

菌落總數(shù)檢測參照GB4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》中的方法測定。

1.3.8 保質期測定

基于加速破壞性試驗對煙熏鱘魚的保質期進行測定。分別取40、60、80℃不同煙熏溫度下加工的煙熏鱘魚樣品進行檢測，每個樣品做3個批次，每個批注產(chǎn)品分別于27、32、37℃下進行貯藏，測定3種樣品的菌落總數(shù)。當菌落總數(shù)超過限定標準時停止檢測并記錄貯藏時間，利用模型計算產(chǎn)品保質期。

式中：S5為貯藏溫度差值為5時保質期比值；T1為已知溫度，℃；T2為所測保質期的溫度，℃；f1、f2分別為T1、T2的保質期，d。

根據(jù)3種產(chǎn)品在不同溫度下的貯藏時間由如下公式計算S5。

式中：S5為貯藏溫度差值為5時保質期比值；f27℃、f32℃和 f37℃分別為 27、32、37 ℃下的保質期，d。

根據(jù)S5計算煙熏鱘魚在4℃貯藏條件下產(chǎn)品的保質期，公式如下。

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式中：S5為貯藏溫度差值為5時保質期比值；f4℃和f37℃分別為4℃和37℃下的保質期。

1.4 揮發(fā)性成分測定

樣品中揮發(fā)性成分測定方法參照宋恭帥等[10-11]的方法，即頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（solid-phase micro-extraction gas chromatography mass spectrometry，SPME-GC/MS）。稱取鱘魚肉樣品5 g置于頂空進樣瓶內，并用鋁圈和硅膠墊片密封，在60℃條件下加熱平衡10 min后，將含有50 μm/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS） 涂層的萃取頭進行老化并插入進樣瓶中，恒溫吸附30 min后取出，并將其插入氣相色譜進樣口，于250℃條件下解析3 min后取出，進行GC-MS分析。

色譜條件：色譜柱為TR-35 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣；進樣口溫度 250℃，不分流進樣；升溫程序為初始溫度40℃，保持3min，以5℃/min升至90℃，再以10℃/min升至230℃，保持7 min。

質譜條件：電子離子源；電子能量70 eV；離子源溫度200℃；檢測器溫度280℃；傳輸線溫度250℃；質量掃描范圍m/z 30～500。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

使用WPS表格對試驗數(shù)據(jù)進行整理和制圖，單因素方差分析（ANOVA）采用SPSS 20軟件，數(shù)據(jù)間的差異由鄧肯氏多變域法確定，p<0.05表示統(tǒng)計學上差異顯著，并使用Simca-p 14.0進行統(tǒng)計學分析[12]。

2 結果與分析

2.1 不同煙熏溫度下鱘魚片的感官評價

煙熏鱘魚片的感官特性主要體現(xiàn)在煙熏味、口感、色澤、組織和回味5方面，其中表面玫紅、內部褐紅、色澤均一，煙熏味適中無腥味，組織緊密口感細膩，回味悠長的煙熏產(chǎn)品最符合消費者購買需求。不同煙熏溫度處理的鱘魚片的品質特征差異見圖1。

圖1 不同煙熏溫度下鱘魚片品質的感官評價Fig.1 The sensory attributes of smoked sturgeon fillets prepared under different temperature

由圖1可知，煙熏鱘魚的色澤受煙熏溫度的影響較大，在40℃時色澤較白，隨著溫度升高顏色逐漸加深，當溫度為80℃時色澤呈玫紅色。溫度對煙熏味和回味也有顯著的影響，在溫度較低時煙熏味較淡，回味不明顯，伴有魚腥味。隨著溫度升高，煙熏鱘魚片的煙熏味和回味均變得濃郁。然而當溫度升至80℃時煙熏味較重。高溫有利于表面水分快速蒸發(fā)，因此在80℃下煙熏鱘魚片的組織較為緊實，而低溫下組織較為疏松，口感相對較為糜爛。

2.2 煙熏溫度對質量損失率的影響

不同煙熏溫度下鱘魚片的質量變化見圖2。

圖2 不同煙熏溫度對鱘魚片質量損失率的影響Fig.2 The effect of temperature on themass loss of smoked sturgeon fillets

由圖2可知，當煙熏溫度為40℃時鱘魚片質量損失僅為4.8%。隨著溫度升高，鱘魚片表面水分蒸發(fā)加速，當溫度為60℃時鱘魚片質量損失率達到了9.4%。進一步提高溫度時，鱘魚片質量損失率在80℃時達到了18.5%。煙熏溫度對鱘魚片的質量變化影響較大。

2.3 煙熏鱘魚TVB-N值和TBARS值變化

TBARS值是目前檢測油脂氧化產(chǎn)物的有效方法，目前被廣泛用于各類脂質產(chǎn)品的檢測。TBARS值是魚肉中不飽和脂質氧化降解產(chǎn)生的丙二醛與2-硫代巴比妥酸反應后生成的一種紅色穩(wěn)定化合物，在煙熏加工過程中TBARS值可以間接反映脂質氧化程度。研究表明人體可接受的TBARS值的閾值約為1 mg/kg，超過該閾值，肉類產(chǎn)品的不良氧化味和風味便可以通過感官預知[13]。不同煙熏溫度對鱘魚片的TVB-N值和TBARS值的影響見表2。

表2 不同煙熏溫度對鱘魚片TVB-N值和TBARS值的影響Table 2 The effect of smoking temperature on the value of TVB-N and TBARS of sturgeon fillets

由表2可知，在煙熏溫度40℃～80℃，鱘魚片的TVB-N值為6.17 mg/100 g～6.41 mg/100 g。在40℃和60℃下煙熏鱘魚片的TBARS值分別為（0.25±0.01）mg/kg和（0.26±0.01）mg/kg。當煙熏溫度升高至80℃時，鱘魚片的 TBARS值為（0.28±0.01）mg/kg。說明隨著煙熏溫度升高，不飽和脂質加速氧化降解使丙二醛加速積累，進而導致TBARS值增大；另一方面，肉類系統(tǒng)中脂質氧化和蛋白氧化存在一定的相互作用，高溫促進了蛋白質氧化并進一步促進了脂肪氧化[14]。盡管煙熏溫度升高有加速鱘魚肉的TBARS值的趨勢，但是并沒有因脂肪氧化而產(chǎn)生不良氧化味和風味。

2.4 苯并芘含量變化

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）是一類具有多稠合芳環(huán)的化合物，通常由木材、煤等不完全燃燒產(chǎn)生。作為致癌物的代表，多環(huán)芳烴在食品中的來源和機理已被廣泛研究，尤其是具有強致癌風險的苯并芘。傳統(tǒng)煙熏食品中大多含有苯并芘，其性質穩(wěn)定、靈敏性好，往往被用作指標化合物評定煙熏食品安全性。根據(jù)動植物油脂中苯并芘的測定的國家標準法和相關文獻報道[15]，本試驗采用高效液相色譜法，通過建立標準曲線測定煙熏鱘魚中的苯并芘含量。不同煙熏溫度下鱘魚片的苯并芘含量變化見圖3。

圖3 不同煙熏溫度對鱘魚片苯并芘含量的影響Fig.3 The effect of temperature on the BaP content of smoked sturgeon fillets

由圖3可知，當煙熏溫度為40℃和60℃時，煙熏鱘魚片中苯并芘含量分別為1.18 μg/kg和1.27 μg/kg，差異不大。當溫度升高到80℃時，煙熏鱘魚片表面苯并芘含量升高至1.58 μg/kg。不同煙熏溫度下加工的鱘魚片均符合熏烤肉中苯并芘含量不超過5 μg/kg的要求。

2.5 煙熏鱘魚保質期研究的變化

煙熏鱘魚片在27、32、37℃的加速試驗中菌落總數(shù)隨貯藏時間的變化見圖4。

圖4 煙熏鱘魚片在27、32、37℃的加速試驗中菌落總數(shù)隨貯藏時間的變化Fig.4 Changes of total number of colonies with storage time in accelerated tests of smoked sturgeon fillet at 27，32℃and 37℃

由圖4可知，在煙熏鱘魚片27、32、37℃的加速試驗中，菌落總數(shù)均隨著貯藏時間延長而增加，3種不同貯藏溫度下的煙熏鱘魚片的貯藏時間分別達到了45、36、30 d。煙熏工藝對微生物的影響主要包括熏煙成分的殺菌作用和煙熏過程中水分流失、水分活度降低對微生物生長繁殖的阻礙作用。熏煙中含有大量的醛類、酚類等具有一定殺菌作用的化合物，因此隨著煙熏物質的逐漸滲透，使鱘魚片的表面和肌肉內部的微生物逐漸失活。由1.3.8計算所得S5為1.225，進一步計算得到煙熏鱘魚片的保質期為114 d。

2.6 揮發(fā)性物質分析

本文采用SPME-GC/MS技術，以2，4，6-三甲基吡啶為內標化合物對經(jīng)不同煙熏溫度（40、60、80℃）處理的鱘魚片樣品中揮發(fā)性物質進行定量分析。煙熏鱘魚片中共檢出32種揮發(fā)性，包括酚類、醇類、酮類、碳氫化合物、酸類、酯類、醛類及其他物質。各類揮發(fā)性成分含量見圖5。

圖5 不同煙熏溫度（40、60、80℃）處理的鱘魚片樣品中揮發(fā)性物質含量變化Fig.5 Variation of volatile matter content in sturgeon fillet samples treated with different fumigation temperatures（40，60，80 ℃）

由圖5可知，酚類化合物含量最高，其中，2-甲氧基-4-丙基-苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、（E）-2-甲氧基-4-（1-丙烯基苯酚）及1，2，4-三甲氧基苯主要是由燃燒的木材中所含木質素所產(chǎn)生的[16]。此外還檢出2，4-二甲基苯酚、愈創(chuàng)木酚及4-乙基苯酚。酚類化合物應是賦予煙熏鱘魚片煙熏香味的主要特征物質。

為了進一步研究不同煙熏溫度對鱘魚肉片中揮發(fā)性物質的影響，對3組樣品中揮發(fā)性成分含量進行主成分分析（principle component analysis，PCA）。PCA是一種簡化數(shù)據(jù)集的數(shù)理統(tǒng)計方法?？赏ㄟ^線性變換將一組可能具有相關性的變量轉換成線性不相關的變量，并稱轉換后的變量為主成分[17]。鱘魚片中揮發(fā)性物質的多元回歸分析見圖6。

如圖6（A）所示，第一與第二主成分貢獻率分別87.6%和6.1%，總貢獻率高達93.7%，說明PCA能較科學地反映3種樣品中揮發(fā)性風味的特征信號。其中A、B和C組樣本分別經(jīng)過40、60、80℃煙熏處理，每組3個樣本共9個樣品信息有效被分成3個有統(tǒng)計學意義的集群，即40、60、80℃煙熏，并分布在不同區(qū)域，說明不同煙熏溫度對鱘魚片中揮發(fā)性成分產(chǎn)生影響。由圖6（B）主成分荷載圖可知，不同樣品中揮發(fā)性成分濃度水平的存在差異性[18-19]。間甲酚、2-甲氧基-4-丙基-苯酚、愈創(chuàng)木酚、異戊醇及對甲酚等揮發(fā)性成分為區(qū)別3種樣品的特征揮發(fā)性化合物。

圖6 多元回歸分析圖Fig.6 Multiple regression analysis diagram

3 討論

魚肉中TVB-N值在風干、熏制、定型等加工過程中呈緩慢上升趨勢，主要由于組織細胞在煙熏加工缺氧條件下，糖原酵解和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）降解產(chǎn)生酸性物質，酸性內環(huán)境使肌肉釋放肌漿中的蛋白酶，從而使魚肉蛋白質分解產(chǎn)生一些胺類等少量含氮物質[20]。部分魚肉組織、細胞破壞分解，胞內酶作用于蛋白質、脂肪等底物，從而產(chǎn)生了少量TVB-N，而水分活度降低和熏煙化合物的增加可有效抑制微生物及其酶對蛋白質、脂肪的降解和腐敗作用，因此上升趨勢較為緩慢。TBARS值與水產(chǎn)腥味密切相關，當TVB-N值高于2.2 mg/kg時魚肉腥味明顯，丙二醛在肉類中超過0.5 mg/kg時加熱即產(chǎn)生異味。熏煙中小分子化合物滲入鱘魚肉具有加速脂肪氧化的作用，磷脂、甘油酯等在脂肪酶的作用下分解為游離脂肪酸，小分子化合物和低水分活度能提高肌肉脂肪酶活性，使煙熏過程中的肌肉脂質水解加速[21]。

苯并芘的致癌性很強，僅需少量即可引起機體的局部組織發(fā)生癌變，也可引起大鼠肝細胞和肺細胞以及外周血淋巴細胞、DNA損傷[22]。同時，苯并芘可能通過呼吸和食道進入人體從而增加乳腺癌的風險，誘發(fā)消化道、肺和膀胱癌。不同的熏烤溫度和時間下產(chǎn)生的苯并芘含量不同。通常煙熏溫度越高，產(chǎn)生苯并芘的量越多。此外，煙熏材料也會影響煙熏鱘魚片中苯并芘含量。趙冰等[23]研究發(fā)現(xiàn)不同的煙熏方式對煙熏制品的苯并芘含量有明顯的影響，其隨著煙熏時間的延長和液熏次數(shù)的增加而升高。鐘昳茹等[24]研究發(fā)現(xiàn)，干燥的木材、樹枝、谷殼等煙熏材料產(chǎn)生的苯并芘含量遠遠低于霉變潮濕的煙熏材料。因此，開發(fā)適應市場需求的煙熏鱘魚片，需在加工過程中嚴格原輔料質量控制和加工衛(wèi)生管理，強化產(chǎn)品質量檢測，優(yōu)選優(yōu)質熏料，改進熏烤工藝[25]。

煙熏食品的保質期取決于原料特性、加工工藝、包裝和貯藏條件等因素，任何因素的改變均可能引起積極或者消極的作用。保證煙熏食品理想的感官、理化和微生物特性，防止短期內出現(xiàn)氧化褐變、風味物質的氧化、脫水收縮或者是潮解等因子是長期以來重要的研究目標。目前已有多種延長煙熏食品保質期的方法[26]。韓衍青等[27]發(fā)現(xiàn)超高壓處理能夠有效延長低溫煙熏火腿的貨架期，不會或較小引起游離脂肪酸和色澤等指標的變化，并較好地保持產(chǎn)品原有營養(yǎng)組成及口感品質。李江林等[28]將石榴皮、可食性膜和乳酸鏈球菌素復配，對黑椒煙熏牛肉保鮮效果進行研究，使黑椒煙熏牛肉在0℃～4℃貯藏保質期達30 d，各項指標仍符合國家衛(wèi)生標準。

4 結論

本試驗研究煙熏溫度對鱘魚片品質產(chǎn)生影響，通過對感官評價、質量損失率、TVB-N值、TBARS值、苯并芘含量和保質期等指標的綜合評價，確定了80℃為最佳煙熏溫度，該條件下煙熏鱘魚片色澤玫紅、煙熏味和回味濃郁、組織緊實。煙熏溫度的升高有助于提高鱘魚片的感官風味，對鱘魚肉中TVB-N值的影響不大。盡管TBARS值和苯并芘有一定程度的上升，對煙熏鱘魚片整體品質影響不大。通過加速破壞性試驗對煙熏鱘魚的保質期進行測定，計算得出煙熏鱘魚片在4℃下保質期為114 d。長期以來，煙熏制品風味提升、苯并芘控制、貯藏期延長的問題限制了煙熏技術的廣泛應用，阻礙了煙熏食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。改進煙熏鱘魚片的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質量，可為煙熏技術的現(xiàn)代化提供技術支撐。