美洲大蠊腸道耐熱堿性蛋白酶產(chǎn)生菌篩選及其酶特性

王 寧，李小波，劉文彬，唐 彬，汪 潔，朱家勇，金小寶

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006)

堿性蛋白酶是一類最適反應(yīng)pH為堿性范圍的蛋白水解酶，在輕工業(yè)(洗滌劑、皮革鞣制等)、食品加工業(yè)(蛋白質(zhì)水解物生產(chǎn)、肉類加工等)、醫(yī)藥工業(yè)(例如，在制藥業(yè)中催化某些合成反應(yīng))中具有廣泛應(yīng)用價值(Kouhdashtetal., 2018; 謝宗波等, 2019)。微生物來源的堿性蛋白酶通常為胞外酶，其產(chǎn)酶量高，適合大規(guī)模生產(chǎn)(袁媛等, 2021)，目前大部分工業(yè)酶制劑是利用微生物生產(chǎn)的。因此，產(chǎn)堿性蛋白酶菌種的分離和選育一直被關(guān)注。

人們一直嘗試從自然界豐富的微生物種群中篩選有應(yīng)用價值的產(chǎn)酶菌種。生長于動物體內(nèi)的一些共存微生物，尤其是各種腸道微生物，在其宿主的消化、營養(yǎng)吸收、抗菌和免疫等生理過程中發(fā)揮重要作用，構(gòu)成了發(fā)現(xiàn)新型天然代謝產(chǎn)物和生物活性酶的特殊生境微生物資源庫(Akbaretal., 2019; 江宇航等, 2020)。目前昆蟲共生菌在生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和生態(tài)等方面已展現(xiàn)出重要的研究和應(yīng)用價值(魏舸等, 2018)。

美洲大蠊是已知最古老的昆蟲之一，有很強(qiáng)的生理和環(huán)境適應(yīng)能力，已在地球上生存了約3.5億年(Liuetal., 2020)。美洲大蠊為雜食性昆蟲，食物來源多樣(包括腐爛的植物和動物肉類等)，且通常生活在溫暖、濕潤、微生物豐富的環(huán)境中，其體內(nèi)或體表可攜帶多種微生物。這些微生物，部分作為人類和動物病原體(細(xì)菌、病毒、寄生蟲等)，已得到了廣泛研究(Abbas, 2019)。另一方面，這些昆蟲的共生菌，其組成具有豐富的多樣性，可作為有益微生物資源(Guzman and Vilcinskas, 2020)。但已有的對蜚蠊共生菌的研究多采用常規(guī)pH培養(yǎng)基(中性或弱酸堿性)進(jìn)行分離和篩選，對這類昆蟲腸道中嗜酸性、嗜堿性或嗜鹽性微生物及其代謝產(chǎn)物和酶的研究有限。事實(shí)上，一些研究表明，某些具有生物技術(shù)重要性的嗜極微生物，也可在普通的非極端環(huán)境中分離到(Low-Décarieetal., 2016; Baselga-Cerveraetal., 2020)。本課題組前期曾以常規(guī)高氏I號瓊脂培養(yǎng)基分離到284株美洲大蠊腸道菌(放線菌159株，其它細(xì)菌125株)(陳至里等, 2016; 蔣詩林等, 2021)，并對相關(guān)菌株的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究。為更充分地挖掘和利用昆蟲腸道菌資源，本研究擬采用含堿性介質(zhì)(Na2CO3)的蛋白酶篩選培養(yǎng)基從美洲大蠊腸道中篩選嗜堿細(xì)菌，并對其所產(chǎn)堿性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用美洲大蠊捕捉自廣州市黃沙輪渡碼頭和黃沙水產(chǎn)交易市場之間橋梁的洞穴中。

支持嗜(耐)堿微生物生長的篩選培養(yǎng)基采用Horikoshi I培養(yǎng)基(Liuetal., 2018)，并作適當(dāng)改動(葡萄糖1 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母提取物5 g/L、K2HPO41 g/L、Mg2SO4-7H2O 0.2 g/L、Na2CO30.15 mol/L、瓊脂粉20 g/L、脫脂奶粉20 g/L)，主要的改動是提高了培養(yǎng)基中的堿性介質(zhì)Na2CO3濃度，以及添加脫脂奶粉作為蛋白酶作用底物。Na2CO3和脫脂奶粉均溶于適量水中單獨(dú)滅菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基采用適宜于芽孢桿菌屬細(xì)菌發(fā)酵的玉米粉-黃豆餅粉培養(yǎng)基，按沈萍和陳向東(2018)的配方稍加改變：玉米粉40 g/L，黃豆餅粉30 g/L，Na2CO30.04 mol/L，CaCO310 g/L?；A(chǔ)的肉湯蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L)按常規(guī)配制，根據(jù)測試目的向其中加入不同pH緩沖液或不同濃度的Na2CO3。

1.2 方法

1.2.1產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的分離和純化

以75%乙醇和無菌水充分清洗美洲大蠊蟲體表面，然后用無菌手術(shù)剪剪開蟲體腹部，取腸道及其內(nèi)容物混合放入0.15 mol/L Na2CO3溶液中，在勻漿器中充分研磨。取勻漿液涂布于含Na2CO3的篩選培養(yǎng)基平板，置28℃倒置培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落出現(xiàn)及牛奶蛋白的水解情況，挑取產(chǎn)生明顯水解圈的菌落，進(jìn)一步以平板劃線分離法進(jìn)行菌種純化。取上述具明顯水解圈的菌株的純化物，再次接種于含Na2CO3篩選培養(yǎng)基和普通肉湯蛋白胨培養(yǎng)基(不含Na2CO3)平板上，置37℃倒置培養(yǎng) 4～5 d，取在普通肉湯蛋白胨培養(yǎng)平板上未見明顯生長、而在含Na2CO3篩選培養(yǎng)平板上能形成牛奶蛋白水解圈的菌株進(jìn)行下一步測試。

1.2.2產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：取菌株純培養(yǎng)物劃線接種于含Na2CO3的平板培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)，觀察菌落特征。取適當(dāng)階段的培養(yǎng)物涂片、固定，分別作革蘭氏染色(結(jié)晶紫初染、碘液媒染、乙醇脫色和沙黃復(fù)染)及芽孢染色(孔雀綠初染、沙黃復(fù)染)后用油鏡觀察。

分子生物學(xué)鑒定：取新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物，應(yīng)用細(xì)菌核糖體16S rDNA序列引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定后送華大基因公司測序。將菌株的16S rDNA序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫已有核酸序列進(jìn)行BLAST比對，采用NCBI-BLAST Tree View程序構(gòu)建進(jìn)化樹(www.ncbi. nlm.nih.gov/blast/treeview/treeView.cgi)(Cardosoetal., 2021)，通過和高度相似序列的比對確定該菌株分類地位(采用Neighbor Joining法構(gòu)建，最大序列差異= 0.75)。

1.2.3溫度、pH和Na2CO3對菌株生長的影響

菌株在含適量Na2CO3的肉湯蛋白胨液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48 h，取該新鮮培養(yǎng)物，制成OD600=1.0的均勻細(xì)菌懸液，用于如下測定：(1)溫度對菌株生長的影響：上述細(xì)菌懸液按0.5%接種量接種于5 mL含Na2CO3(0.04 mol/L)的肉湯蛋白胨培養(yǎng)基中，分別在25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)液是否渾濁，并測定培養(yǎng)液的OD600值，考察溫度對菌株生長的影響。每個樣品設(shè)3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。(2)pH和Na2CO3濃度對菌株生長的影響：上述細(xì)菌懸液按0.5%接種量接種于5 mL pH分別為7、8、9、10、11、12(以及Na2CO3濃度分別為0、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mol/L)的肉湯蛋白胨培養(yǎng)基中，在前述確定的最適生長溫度條件下振蕩培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)液是否渾濁，并測定培養(yǎng)液的OD600值，分別考察pH和Na2CO3對菌株生長的影響。每個樣品設(shè)3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.2.4菌株發(fā)酵和粗酶液制備

將菌株接種到玉米粉-黃豆餅粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)144 h，其間每隔12 h取發(fā)酵液離心，取上清(粗酶液)測定其在60℃、pH11條件下的蛋白酶活性，以確定發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)蛋白酶活性的影響。后續(xù)SDS-PAGE酶譜法定性檢測及酶學(xué)性質(zhì)測試所用粗酶液，均按上述確定的產(chǎn)酶最佳發(fā)酵時間培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心制備。

1.2.5堿性蛋白酶活性的SDS-PAGE酶譜法定性檢測

參考Tarrahimofradetal.(2020)的方法略作改動，以酪蛋白為底物進(jìn)行蛋白酶活性的SDS-PAGE酶譜法檢測：將上清與5×上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離膠中含0.1%酪蛋白，于冰水浴中低溫電泳，電泳結(jié)束后，凝膠浸入含1% Triton X100的硼酸鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH=11)中，60℃孵育2 h，漂洗后用考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察蛋白質(zhì)降解區(qū)域顯現(xiàn)狀況。

1.2.6酶學(xué)性質(zhì)測試

以菌株發(fā)酵液離心上清作為粗酶液，進(jìn)行如下測定：(1)反應(yīng)溫度對酶活性的影響：反應(yīng)溫度設(shè)定為兩組：首先在20～100℃范圍內(nèi)(間隔10℃)進(jìn)行測試，可初步判斷酶最適反應(yīng)溫度的大致范圍。然后，在一個較小溫度范圍內(nèi)(50～70℃，間隔2℃)測試，可較精確地確定酶的最適反應(yīng)溫度。(2)反應(yīng)pH對酶活性的影響：用相應(yīng)pH的緩沖液配制的1%酪蛋白為底物，分別測定在pH 7、8、9、10、11、12、13條件下堿性蛋白酶的活性，確定堿性蛋白酶的最適反應(yīng)pH，反應(yīng)在最適反應(yīng)溫度條件下進(jìn)行。(3)酶熱穩(wěn)定性的定量測定：將粗酶液分別在40℃、60℃、80℃、100℃條件下水浴，所有溫度處理后的粗酶液均分別在1 h、2 h、3 h、4 h取出，置于冰上。待所有粗酶液取出后，在最適反應(yīng)溫度和pH條件下測定酶活力，計(jì)算其相對于未進(jìn)行熱處理的殘留酶活性(相對酶活性)，確定酶的熱穩(wěn)定性。(4)酶熱穩(wěn)定性的SDS-PAGE酶譜法檢測：將粗酶液分別于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃條件下水浴10 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(分離膠中含0.1%酪蛋白)，電泳后照前述方法反應(yīng)并染色，觀察蛋白質(zhì)降解區(qū)域顯現(xiàn)狀況。(5)酶在不同pH條件下的穩(wěn)定性測試：將粗酶液分別和pH為7、8、9、10、11、12的緩沖液等體積混合，4℃靜置24 h，然后測定酶活力，計(jì)算其殘留酶活性(相對酶活性)，確定在不同pH條件下酶的穩(wěn)定性。

堿性蛋白酶活力的定量測定采用福林-酚試劑法進(jìn)行，操作主要參考沈萍和陳向東(2018)和現(xiàn)行蛋白酶制劑國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T23527-2009)中的方法進(jìn)行，簡述如下：粗酶液和酪蛋白混合后水浴反應(yīng)10 min，加三氯醋酸以終止反應(yīng)，離心后取上清加入Na2CO3和福林-酚試劑，測定其OD680值?？瞻讓φ战M為粗酶液中首先加三氯醋酸以使酶滅活，然后加酪蛋白，其它條件保持一致。每個樣品設(shè)3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。酶活力單位定義：1 mL粗酶液在一定溫度和pH條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，即為1個活力單位，以U/mL表示。計(jì)算公式：酶活力(U/mL)=K×A×N×(5/10)。式中：K為比色常數(shù)，A為樣品OD值與空白對照OD值之差，N為酶樣品稀釋倍數(shù)，5為測定OD值時終止反應(yīng)液的稀釋倍數(shù)，10為酶反應(yīng)時間(min)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的初步篩選結(jié)果

美洲大蠊腸道及其內(nèi)容物勻漿液在初篩平板上培養(yǎng)5～7 d后，共得到3個可產(chǎn)生明顯牛奶水解圈的菌株。經(jīng)劃線分離、純化后，重新接種進(jìn)行復(fù)篩，僅一株生長良好且可形成牛奶水解圈(圖1-A, B)，而在不含Na2CO3的肉湯蛋白胨培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)未見明顯生長，初步說明該菌株具有嗜堿性，并可分泌堿性蛋白酶，將其命名為PaGA523-1。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

在含Na2CO3的肉湯蛋白胨培養(yǎng)基平板上，菌株P(guān)aGA523-1的菌落呈圓形，凸起、光滑，乳白色-乳黃色(圖1-A)。經(jīng)革蘭氏染色，油鏡下觀察見革蘭氏染色陽性短桿狀菌(圖1-C)。經(jīng)芽孢染色，細(xì)胞中可見綠色芽孢(圖1-D)。

圖1 菌株P(guān)aGA523-1菌落和染色特征Fig.1 The colony and staining characteristics of strain PaGA523-1注：A，菌落；B，形成的牛奶蛋白水解圈；C，革蘭氏染色；D，芽孢染色。Note: A, Colony characteristics; B, Milk protein hydrolysis zone of strain PaGA523-1 on agar plate; C, Gram staining characteristics; D, Spore staining characteristics.

2.2.2菌株16S rDNA基因序列分析

以PaGA523-1基因組為底物，用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增菌株16S rDNA序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR產(chǎn)物約為1 500 bp(圖2-A)。

菌株16S rDNA序列進(jìn)行NCBI-BLAST比對后構(gòu)建的進(jìn)化樹分析顯示(圖2-B)，PaGA523-1和芽孢桿菌屬各種細(xì)菌的16S rDNA序列形成一個大的分支，且和其中的BacilluslehensisG1株(GenBank No.CP003923.1)距離最近，其相似率為99.24%。結(jié)合菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)特征、16S rDNA基因序列分析，菌株P(guān)aGA523-1可被確定為B.lehensis。將菌株P(guān)aGA523-1的16S rDNA序列在NCBI-GenBank進(jìn)行注冊，獲得注冊號MZ448243。

圖2 菌株P(guān)aGA523-1 16S rDNA基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳和進(jìn)化樹分析Fig.2 PCR product of 16S rDNA of strain PaGA523-1 and its phylogenetic tree analysis注：A，瓊脂糖電泳。Lane M，DNA marker；Lane 1，PCR product。B，進(jìn)化樹分析。Note: A, Agarose gel electrophoresis. Lane M, DNA marker; Lane 1, PCR product. B, Phylogenetic tree analysis.

2.3 溫度、pH和Na2CO3對菌株生長的影響

以肉湯蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別考察了溫度、pH對菌株生長的影響，結(jié)果顯示，其最適生長溫度為37℃(圖3-A)，最適生長pH范圍為9～11(圖3-B)，可在含0.03～0.09 mol/L Na2CO3的肉湯蛋白胨液體培養(yǎng)基中良好生長，其最適濃度范圍為0.03～0.06 mol/L(圖3-C)。

圖3 溫度、pH和Na2CO3對菌株P(guān)aGA523-1生長的影響Fig.3 Effect of temperature, pH and Na2CO3 on the growth of strain PaGA523-1注：A，溫度；B，pH；C，Na2CO3。Note: A, Temperature; B, pH; C, Na2CO3.

2.4 發(fā)酵時間對酶活性的影響

菌株在玉米粉-黃豆餅粉發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃連續(xù)振蕩培養(yǎng)144 h，每隔12 h取發(fā)酵上清檢測堿性蛋白酶活性。結(jié)果顯示，發(fā)酵時間96 h堿性蛋白酶活性達(dá)最高值，并在96～120 h趨于穩(wěn)定，120 h后酶活性開始呈下降趨勢(圖4)。

圖4 發(fā)酵時間對蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the protease activity

2.5 堿性蛋白酶活性的SDS-PAGE酶譜法檢測

未經(jīng)煮沸變性的發(fā)酵上清經(jīng)電泳后在硼酸鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH=11)中孵育2 h，可在含酪蛋白的SDS-PAGE凝膠中形成一條明顯的降解條帶，定性說明菌株可產(chǎn)生堿性蛋白酶(圖5)。

圖5 堿性蛋白酶活性的SDS-PAGE酶譜法檢測Fig.5 Alkaline protease activity assay using SDS-PAGE zymography注：Lane M，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；Lane 1，酶經(jīng)煮沸變性；Lane 2，酶不經(jīng)煮沸變性。Note: Lane M, Protein molecular weight marker; Lane 1, Boiled enzymes; Lane 2, Non-boiled enzymes.

2.6 酶學(xué)性質(zhì)測定

2.6.1反應(yīng)溫度對酶活性的影響

在較寬范圍內(nèi)(20～100℃)測試溫度對酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)在50～70℃范圍內(nèi)酶均有一定酪蛋白降解活性，初步估計(jì)最適反應(yīng)溫度在60℃左右(圖6-A)。然后，在50～70℃范圍內(nèi)進(jìn)行測試，確定其最適反應(yīng)溫度為62℃(圖6-B)。

圖6 溫度對蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on the protease activity and stability注：A，反應(yīng)溫度對酶活性的影響(20～100℃)；B，反應(yīng)溫度對酶活性的影響(50～70℃)；C，酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性。Note: A, Effect of reaction temperature on the protease activity (20～100℃); B, Effect of reaction temperature on the protease activity (50～70℃); C, Thermal stability of protease at different temperature.

2.6.2酶的熱穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性測試表明，60℃(接近其最適反應(yīng)溫度)孵育1 h后，粗酶液仍保留其初始活性的62.68%，說明酶具有一定程度的熱穩(wěn)定性(圖6-C)。

SDS-PAGE酶譜檢測結(jié)果也表明，酶經(jīng)40℃、50℃、60℃處理10 min后，仍然能在SDS-PAGE凝膠上呈現(xiàn)明顯降解條帶。隨著處理溫度的升高，其降解強(qiáng)度減弱，90℃處理后僅能表現(xiàn)微弱降解條帶(圖7)。

圖7 熱穩(wěn)定性的SDS-PAGE酶譜檢測Fig.7 Thermal stability of protease at different temperature (SDS-PAGE zymography)注：Lane M，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；Lane 1～6，蛋白酶經(jīng)40，50，60，70，80，90℃熱處理10 min。Note: Lane M, protein molecular weight marker; Lane 1～6, protease was heat treated at 40, 50, 60, 70, 80 and 90℃ for 10 min.

2.6.3反應(yīng)pH對酶活性的影響

在中性和堿性環(huán)境中測試pH對酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)在pH 7～12范圍內(nèi)酶均顯示一定程度的酪蛋白降解活性，其最適反應(yīng)pH范圍是9～11(圖8-A)。

2.6.4酶在不同pH條件下的穩(wěn)定性

酶分別在pH為7、8、9、10、11、12的緩沖液中4℃保存24 h后，仍然保留大部分活性，結(jié)合其最適反應(yīng)pH為堿性的結(jié)果，說明其在堿性條件下具有一定穩(wěn)定性(圖8-B)。

圖8 pH對酶活性和穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on the protease activity and stability注：A，反應(yīng)pH對酶活性的影響；B，酶在不同pH條件下的穩(wěn)定性。Note: A, Effect of reaction pH on enzyme activity; B, Stability of the enzyme under different pH conditions.

3 結(jié)論與討論

昆蟲構(gòu)成了最豐富和最多樣化的動物類群，其體內(nèi)有種類繁多的共生菌，可為宿主提供有益的次級代謝物、酶和營養(yǎng)物質(zhì)，它們在宿主生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用(劉潤進(jìn)和王琳, 2018)。作為生境獨(dú)特的一類微生物，昆蟲腸道細(xì)菌和真菌所產(chǎn)生的一些水解酶，如蛋白酶、脂肪酶、多糖降解酶(木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶等)，被認(rèn)為可為工業(yè)酶的篩選和利用提供新的來源而得到廣泛研究(Liangetal., 2018)。本研究從美洲大蠊腸道內(nèi)分離到一株嗜堿性的芽孢桿菌，其分泌的蛋白酶是一種耐堿耐高溫酶，在食品和飼料加工、生物活性肽生產(chǎn)及疾病治療等方面具有潛在應(yīng)用價值。

嗜堿微生物可從多種環(huán)境中分離到，除鹽堿湖等外，還可從昆蟲腸道、動物糞便、植物體及其根際土壤等非堿性環(huán)境中分離得到(Borkar, 2015; Banerjeeetal., 2017; Yueetal., 2017; Sandeshetal., 2019; Shinetal., 2020)。本研究從雜食性昆蟲美洲大蠊腸道中分離得到嗜堿性的芽孢桿菌B.lehensisPaGA523-1菌株，并測試其所產(chǎn)蛋白酶性質(zhì)。菌種B.lehensis來源和應(yīng)用范圍比較廣范，有研究者從多種環(huán)境中分離到其它B.lehensis菌株，如沙漠鹽漬土(Bhatt and Singh, 2020)、木薯廠廢水(Amorimetal., 2020)、橡膠園土壤(Abd Rahmanetal., 2020; Jaafaretal., 2020; Nawawietal., 2020)，分別進(jìn)行了蛋白酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、果聚糖酶、內(nèi)切-β-1, 3-葡聚糖酶、麥芽糖淀粉酶等研究。

熱穩(wěn)定性是影響酶的工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。在工業(yè)應(yīng)用中，較常溫酶而言，熱穩(wěn)定酶具有一些優(yōu)勢，如在較高反應(yīng)溫度下具有更高的活性水平、穩(wěn)定性和更快的反應(yīng)速度(Lietal., 2014)。Joshi and Satyanarayana (2013)利用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了從印度土壤分離到的B.lehensisMTCC7633菌株的一種堿性蛋白酶BLAP(編碼基因ORF全長為1 140 bp)，其最適反應(yīng)溫度為50℃；Sulaimanetal.(2019)從馬來西亞橡膠園土壤來源的嗜堿性B.lehensisG1菌株發(fā)酵上清液中得到的堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度40℃；Bhatt and Singh (2020)利用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了分離自鹽堿地的B.lehensisJO-26菌株的一種堿性蛋白酶APrBL(編碼基因ORF全長為1 014 bp)，其最適反應(yīng)溫度為50℃。本研究中所分離到的嗜堿性菌株B.lehensisPaGA523-1所分泌的堿性蛋白酶，在50～70℃內(nèi)可發(fā)揮良好的蛋白質(zhì)水解活性，其最適反應(yīng)溫度為62℃，均高于上述研究者所得到的結(jié)果，具有進(jìn)一步研究價值。熱穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，該蛋白酶在60°C(接近最適反應(yīng)溫度)處理1 h后仍具有62.68%的活性，另一方面，SDS-PAGE酶譜法檢測結(jié)果也定性說明該堿性蛋白酶具有一定程度的熱穩(wěn)定性，表明其可以視作一種良好的熱穩(wěn)定酶。在飼料和食品加工業(yè)中，通常會使用高溫發(fā)酵等工藝，該蛋白酶的熱穩(wěn)定特性可使其在這類生產(chǎn)過程中發(fā)揮較好水解作用。此外，這種耐熱酶的最適反應(yīng)pH值范圍為9～11，且在堿性條件下表現(xiàn)一定的穩(wěn)定性，與Joshi & Satyanarayana (2013)的研究結(jié)果相近。獨(dú)特的耐高溫和耐堿的酶學(xué)特性，使其在蛋白質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化方面具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢。

綜上所述，本研究從美洲大蠊腸道分離出一株嗜堿性的芽孢桿菌B.lehensisPaGA523-1，其最適生長pH范圍為9～11，最適生長溫度為37℃。該菌株所分泌的堿性蛋白酶最適反應(yīng)溫度為62℃，最適反應(yīng)pH范圍為9～11，且具有一定的熱穩(wěn)定性和耐堿性。該蛋白酶的耐熱耐堿特性表明其有潛在工業(yè)應(yīng)用價值,值得進(jìn)一步深入研究。