家蠅微生物感染對RNA干擾GNBP3基因的作用

胡 亞，羅 嫚，吳建偉

(1. 畢節(jié)市第一人民醫(yī)院，貴州畢節(jié) 551700；2. 畢節(jié)市中醫(yī)院，貴州畢節(jié) 551700；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550004)

隨著免疫抑制劑及廣譜抗生素的大量使用，真菌感染尤其是白色念珠菌引起的機會性感染逐年增加，已嚴重威脅著人類生命健康(Marchettietal., 2004; Alastruey-Izquierdoetal., 2013; Yuetal., 2013)。宿主的免疫反應(yīng)抵御白色念珠菌的入侵，而對于宿主-病原菌相互作用的免疫應(yīng)答反應(yīng)還缺乏適合的動物模型。因此，利用合適的動物模型深入研究真菌感染后宿主的免疫應(yīng)答變化及其調(diào)控機制是非常必要的。先天免疫系統(tǒng)是宿主抵御病原入侵的第一防線，昆蟲的先天性免疫系統(tǒng)具有高效抵御微生物病原侵害的效能，應(yīng)用昆蟲作為實驗?zāi)Ｐ偷膶嶒灲Y(jié)果不受獲得性免疫應(yīng)答的干擾，因此，大蠟蛾蠟螟Galleriamellonella、家蠶Bombyxmori、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、象鼻蟲Bollweevil等昆蟲已成為研究病原微生物與宿主之間先天免疫的重要模型(Pollardetal., 2012; 徐穎, 2012; Afonso-Barrosoetal., 2013; Huetetal., 2013; Rader and Guillemin, 2013; Rivas-Santiagoetal., 2013)。

昆蟲體液免疫在其先天性免疫中起關(guān)鍵作用(Kounatidis and Ligoxygakis, 2012)。昆蟲機體受微生物入侵后，體液中的分泌型模式識別受體(PRR, Pattern Recognition Receptor)對病原微生物的病原相關(guān)分子模式(PAMPs, Pathogen associated molecular patterns)進行識別，通過信號通路進行轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控，最終促使脂肪體細胞合成抗菌肽，抗菌肽分泌到血淋巴中殺死入侵的病原體(Kurata, 2014; 胡亞等, 2016)。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽的表達主要由Toll信號通路和IMD信號通路控制(Lemaitre and Hoffmann, 2007; 修江帆等, 2014)，其中真菌與大多數(shù)革蘭氏陽性菌激活Toll信號途徑，革蘭氏陰性菌激活I(lǐng)MD信號通路(Sony and Yonggyun, 2010; Choetal., 2012; Kleino and Silverman, 2014)，抵御并消除病原微生物對機體的損傷，這一復(fù)雜的過程是基于昆蟲體液免疫模式識別微生物的病原相關(guān)分子。

在Toll受體介導(dǎo)的信號通路中，真菌感染靶生物時，機體啟動免疫防御主要依賴于體液免疫系統(tǒng)對外源微生物的非特異性識別。真菌細胞壁中的β-1,3葡聚糖作為基本功能單位，可直接與靶生物體液中的革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白-3 (GNBP3, Gramnegative bacteriabinding protein 3)的功能結(jié)構(gòu)域相互作用，從而完成免疫系統(tǒng)對侵入體液中真菌的識別(Mishimaetal., 2009)，如在果蠅(Matskevichetal., 2010; Fullaondoetal., 2011)、黃粉蟲(Leeetal., 2009)中，GNBP3結(jié)合β-1,3葡聚糖，然后迅速活化Toll信號通路上游的一系列信號級聯(lián)傳遞，最終啟動抗菌肽的轉(zhuǎn)錄，參與抗真菌防御(胡亞等, 2016)。

家蠅Muscadomestica是世界性昆蟲，隸屬于昆蟲綱雙翅目環(huán)裂亞目蠅科家蠅屬，孳生環(huán)境復(fù)雜，是重要的媒介昆蟲之一(魏川川等, 2015)，其體表可攜帶多種病原體而自身很少受害，說明家蠅比其它昆蟲可能具有更強大的先天免疫系統(tǒng)(修江帆等, 2014; 王宇等, 2015; 彭傳林等, 2015)。目前國內(nèi)學(xué)者研究已表明，家蠅能夠產(chǎn)生attacin、cecropin、defensin、diptericin等多種常見抗真菌多肽(Wangetal., 2003; Liangetal., 2006; Liuetal., 2011; Jinetal., 2013)。家蠅基因組和Jeffrey等( 2014)的研究結(jié)果表明GNBP3是信號通路上游的模式識別受體，參與昆蟲先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)對真菌的識別，其能夠識別真菌細胞壁中的β-1,3葡聚糖，完成免疫系統(tǒng)對侵入體液中真菌的識別，從而宿主對真菌產(chǎn)生免疫抵抗，且根據(jù)本課題組前期家蠅轉(zhuǎn)錄組分析表明，GNBP3是家蠅迄今為止唯一的一個GNBP基因編碼的真菌模式識別受體(胡亞等, 2016)，而有關(guān)GNBP3在家蠅感染后的表達情況及抗菌肽的表達情況，國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究報道，GNBP3在家蠅先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮什么作用還不清楚。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)可調(diào)節(jié)大多數(shù)動植物基因表達和用于研究抗病毒防御的發(fā)生(Fireetal., 1998)，已成為功能基因組學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用的重要工具(Price and Gatehouse, 2008; Kurreck, 2009)。一旦宿主細胞對dsRNA產(chǎn)生反應(yīng)，其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA(siRNA)，siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，RISC與基因表達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結(jié)合，從而誘發(fā)宿主細胞降解mRNA(Siomietal., 2011)。因此，本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默家蠅GNBP3基因，以微生物感染家蠅幼蟲，研究家蠅幼蟲GNBP3對真菌感染的功能作用，并評價真菌感染后對下游抗菌肽水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種與實驗昆蟲

家蠅是由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室長期飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為 25～28℃，相對濕度為70%～80%，光照周期為12 h光照/12 h黑暗循環(huán)。家蠅幼蟲RNA干擾模型的飼養(yǎng)溫度是20～25℃，飼以麥麩、熱滅活酵母、水等。大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、白色念珠菌CanidiaAlbicans由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室保存。

1.1.2主要試劑及儀器

SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)試劑盒、rTaq酶、分子量標(biāo)準DNA marker DL2000、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖小⒖俁NA提取試劑TRIzol Reagent、DNA凝膠回收試劑盒質(zhì)粒、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit試劑盒、DEPC水(焦碳酸二乙酯)均購自Takara公司；MEGAscriptR RNAi Kit合成試劑盒(美國)；所用引物由上海生工生物工程公司合成。ABI PRISM 7300 Fast real time PCR System(美國)；核酸定量分析儀(GeneQuant公司)；PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)；顯微解剖鏡(尼康)；顯微超微量注射儀(美國)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI公布的家蠅基因組GNBP3基因預(yù)測序列、內(nèi)參基因RPS18和抗菌肽基因defensin、cecropins、diptericin的基因序列，運用Primer 5.0軟件設(shè)計內(nèi)參RPS18基因、GNBP3基因和抗菌肽基因的q-PCR引物及GNBP3基因和GFP基因的dsRNA合成引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列如下(表1)。

表1 本文中所使用的引物

1.2.2雙鏈RNA的制備

1.2.2.1 基因PCR擴增及線性DNA片段合成

以課題組保存的家蠅質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及回收純化。以純化PCR產(chǎn)物為模板，引物為含有T7啟動子的GNBP3引物，PCR擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s ，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min(羅嫚, 2017)。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后用DNA凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，并進行濃度測定。

1.2.2.2 dsRNA的初步合成

以上述純化PCR產(chǎn)物為模板，定量為1 μg進行dsRNA的合成，將無RNase的PCR小管(200 μL)置于冰盒上，Linear template DNA 1～2 μg，CTP Solution 2.0 μL，UTP Solution 2.0 μL，ATP Solution 2.0 μL，GTP Solution 2.0 μL，10×T7 Reaction Buffer 2.0 μL，T7 Enzyme Mix 2.0 μL，Nuclease-free Water至20.0 μL。輕輕混勻后瞬時離心，37℃孵育6 h(最佳孵育時間根據(jù)基因長度而定)。

1.2.2.3 去除DNA和ssRNA及純化dsRNA

加入反應(yīng)體系dsRNA(1.2.2.2)20 μL，Nuclease-free Water 21 μL，10×Digestion Buffer 5.0 μL，DNase I 2.0 μL，RNase I 2.0 μL，總體積為50 μL。輕輕混勻后瞬時離心，37℃孵育1 h(不得超過2 h)。加入dsRNA 50 μL，10×Binding Buffer 50 μL，Nuclease-free Water 150 μL，100% Ethanol 250 μL，總體積至500 μL進行純化并測定濃度，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3dsRNA注射家蠅幼蟲

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選擇家蠅2齡幼蟲，幼蟲體表依次用75%酒精及滅菌水進行擦拭，然后用干凈紙巾吸干幼蟲體表的水分(羅嫚, 2017)。對家蠅2齡幼蟲利用顯微超微量注射儀注射dsRNA(定量為2 μg)，設(shè)立GNBP3RNA干擾實驗組，同時注射dsGFP作為對照組，并設(shè)立空白對照組，每組100頭幼蟲，將其飼養(yǎng)于20℃恒溫培養(yǎng)箱中。參照鐘鳴研究結(jié)果(鐘鳴, 2014)，設(shè)立干擾時間點分別為24 h、48 h和72 h，收集樣本以確定最佳干擾時間點，記錄RNA干擾后家蠅幼蟲的死亡和化蛹等生理學(xué)特性，進行3次重復(fù)實驗。

1.2.4微生物感染

以白色念珠菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌作為感染源，通過喂食途徑感染RNA干擾24 h后并饑餓6 h的家蠅幼蟲(dsGFP組和dsGNBP3組)，細菌感染濃度為1×108CFU/mL，設(shè)置為感染組，感染過程參照王宇對家蠅幼蟲經(jīng)口途徑飼喂白色念珠菌感染模型的建立(王宇, 2016; 羅嫚, 2017)。同時設(shè)置未感染對照組，感染后6 h進行各標(biāo)本的收集，-80℃保存?zhèn)溆?。每組進行3個重復(fù)實驗。

1.2.5樣本總RNA的提取及cDNA合成

對所有收集標(biāo)本，按照Takara公司TRIzol說明書提取總RNA。取總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，同時測定A260/280比值及濃度。以1 μg總RNA為模板進行cDNA的合成，合成的cDNA保存于-80℃冰箱中備用。

1.2.6熒光定量PCR檢測

取家蠅2齡幼蟲RNA干擾不同時間點(24 h、48 h和72 h)(dsGFP對照組、dsGNBP3實驗組和空白對照組)cDNA(1 ∶10稀釋)為模板，以GNBP3為目的基因，RPS18為內(nèi)參基因，使用ABI PRISM 7300 (ABI, USA)進行熒光PCR，確定最佳干擾時間，每個樣品重復(fù)3次，每組3個重復(fù)。同樣取家蠅微生物(大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌)感染樣本(PBS對照組及感染組(dsGFP組和dsGNBP3組))cDNA(1 ∶10稀釋)為模板，以defensin、cecropins、diptericin為目的基因，RPS18為內(nèi)參基因，按照q-PCR試劑盒說明進行RT-PCR反應(yīng)，以檢測抗菌肽基因表達情況，進行3×3重復(fù)實驗。反應(yīng)體系為：2×SYBR premixEX Taq II 10 μL、上游引物+下游引物1.6 μL、ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL、cDNA 1.0 μL, 加無RNA酶的水(RNase Free dH20)補足至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，確認real-time PCR的溶解曲線和擴增曲線。

1.2.7數(shù)據(jù)處理及分析

采用RPS18作為內(nèi)參照，用RPS18的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，按目的基因表達量=2-△△Ct計算各細菌感染樣本中目的基因mRNA的相對表達含量(胡亞等, 2016)。采用Graphpad prism 6統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用組間t檢驗進行分析，P<0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GNBP3基因RNA干擾效率檢測

采用q-PCR方法檢測RNA干擾后GNBP3mRNA相對表達量。通過對家蠅2齡幼蟲注射GNBP3dsRNA(2 μg)并收集注射后24 h、48 h和72 h樣本，以檢測GNBP3mRNA的表達情況。結(jié)果表明，RNA干擾GNBP324 h后，較GFPRNAi對照組和空白對照組，GNBP3基因表達量下降了大約90%，最佳的干擾效果在48 h時(圖1)。此實驗表明在干擾后24 h時GNBP3基因取得了較好的抑制作用，為進一步實驗提供了依據(jù)。

圖1 注射dsRNA后GNBP3基因的相對表達量Fig.1 Relative gene expression of GNBP3 over time by dsRNA treatment注：NC，空白對照組；GFP，dsGFP對照組；GNBP3，dsGNBP3實驗組；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。Note: NC, Normal control; GFP, dsGFP control group; GNBP3, dsGNBP3 experience group.

2.2 RNA干擾后檢測家蠅生理學(xué)指標(biāo)

通過對家蠅幼蟲注射dsGNBP3已達到沉默GNBP3基因的目的，檢測GNBP3基因在RNA干擾后是否會影響家蠅幼蟲的化蛹及存活等生理學(xué)指標(biāo)，以探究其在家蠅中所起的重要作用。結(jié)果顯示，與對照組相比，家蠅幼蟲在RNA干擾后的存活率隨時間的變化逐漸降低，最終存活率低于50%(圖2)。除此之外，家蠅幼蟲的化蛹率也顯著降低(圖3)。

圖2 RNA干擾后家蠅幼蟲存活率Fig.2 Survival rate of housefly larvae after RNA interference注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001。下圖同。Note:The same below.

圖3 RNA干擾后家蠅幼蟲化蛹率Fig.3 Pupation rate of housefly larvae after RNA interference

2.3 RNAi家蠅GNBP3基因后抗菌肽基因的表達情況

以白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為感染源，通過喂食感染家蠅RNA干擾模型(dsGFP組和dsGNBP3組)，通過q-PCR方法檢測抗菌肽基因的表達情況。結(jié)果顯示，在GFPRNAi組和GNBP3RNAi組之間，對于不同微生物感染其抗菌肽基因(cecropins、defensin、diptericin)表達情況各有差異。

對家蠅cecropins基因的表達量進行分析后發(fā)現(xiàn)，在未感染組中，RNA干擾GNBP3后cecropins的表達量顯著性降低；而白色念珠菌感染后，cecropins的表達與未感染組呈相似的趨勢(圖4-A,P<0.0001)；但是，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染后，在GNBP3RNAi后cecropins的表達量顯著提高(圖4-A,P<0.05)。

對家蠅diptericin基因的表達量進行分析后發(fā)現(xiàn)，在未感染組中，RNA干擾GNBP3后diptericin的表達量顯著性降低(圖4-B,P<0.0001)；而大腸桿菌和白色念珠菌感染后，在GNBP3RNAi后diptericin的表達量顯著提高(圖4-B,P<0.05)；但金黃色葡萄球菌感染后其表達在兩組間無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4-B,P>0.05)。

對家蠅defensin基因的表達量進行分析后發(fā)現(xiàn)，在未感染組中，RNA干擾GNBP3后defensin的表達量顯著性降低(圖4-C,P<0.05)；而白色念珠菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌感染后其表達在兩組間均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4-C,P>0.05)。這說明GNBP3基因在家蠅先天性免疫應(yīng)答中起著重要作用，推測與其它免疫途徑協(xié)同調(diào)節(jié)家蠅免疫應(yīng)答。

圖4 RNAi GNBP3后家蠅抗菌肽基因的表達情況Fig.4 Housefly AMP genes expression after RNAi of GNBP3注：A，天蠶抗菌肽；B，雙翅肽；C，防御素。Note: A, Cecropins; B, Diptericin; C, Defensin.

3 結(jié)論與討論

革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白-3 (GNBP3)作為昆蟲先天性免疫病原識別因子，參與昆蟲先天性免疫應(yīng)答，其能夠識別真菌細胞壁中的β-1,3葡聚糖完成免疫系統(tǒng)對侵入體液中真菌的識別(Mishimaetal., 2009; Matskevichetal., 2010; Fullaondoetal., 2011)。家蠅Muscadomestica孳生于雜亂菌叢的環(huán)境中傳播疾病，是重要的媒介昆蟲，其有效的免疫防御系統(tǒng)得到很多研究者的關(guān)注，而對于家蠅GNBP3基因及其感染后表達水平的研究未見報道(胡亞等, 2016)。近年來，基因敲除技術(shù)逐漸成為研究基因功能必不可少的工具，但傳統(tǒng)的基因敲除很難獲得功能缺失的實驗個體，RNAi技術(shù)是一種利用特異雙鏈RNA引起目的基因沉默的方法，在基因功能分析的研究領(lǐng)域應(yīng)用得尤為廣泛。

本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默家蠅GNBP3基因，檢測GNBP3基因的干擾效率及家蠅幼蟲在干擾后的生理學(xué)指標(biāo)(化蛹率及存活率)，對已確定家蠅GNBP3基因干擾模型進行微生物感染(以白色念珠菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌作為感染源)，通過q-PCR方法檢測抗菌肽基因(cecropins、defensin及diptericin)的表達情況。經(jīng)過前期預(yù)實驗，對各齡期家蠅幼蟲進行dsRNA注射，以確定dsRNA注射的最佳齡期及濃度，注射家蠅1齡幼蟲后，由于此期家蠅幼蟲個體小，體壁薄，及針刺刺激，其死亡率達到100%，注射家蠅3齡幼蟲后，由于家蠅幼蟲受到外界刺激，使得其化蛹時間提前，無法完成后續(xù)實驗，對各齡期幼蟲注射濃度為1 μg時，并未達到干擾效果。對家蠅2齡幼蟲注射dsGNBP3(定量為2 μg)，結(jié)果顯示，在干擾后24 h時家蠅GNBP3基因已達到有效沉默，其干擾效率達到90%左右，在48 h時沉默效果達到最佳，但72 h時沉默效率有復(fù)蘇的情況，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其次，RNA干擾家蠅GNBP3基因后，家蠅幼蟲的存活率逐漸降低達50%以上，同時化蛹率降低，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這說明家蠅GNBP3基因能夠影響家蠅幼蟲的生長發(fā)育，推測干擾家蠅GNBP3基因后，擾亂了家蠅幼蟲體內(nèi)的菌群平衡狀態(tài)，造成其死亡率增高及化蛹推遲現(xiàn)象。RNA干擾家蠅GNBP3基因24 h后并饑餓6 h幼蟲，再進行微生物感染6 h，抗菌肽基因的表達各有差異。對于未感染組，GNBP3RNAi組抗菌肽基因(defensin、cecropins及diptericin)的表達較GFPRNAi組呈顯著性降低(P<0.05)。GFP是一種理想的報告基因，對宿主的生理并無影響，同時它可以顯示生物體一個或多個基因的表達狀況，所以GFPRNAi后對家蠅幼蟲沒有影響卻可以顯示GNBP3基因和抗菌肽基因的表達情況，在未感染時GFPRNAi后GNBP3基因正常表達，抗菌肽基因也正常表達，當(dāng)GNBP3RNAi后使抗菌肽基因呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，就此GNBP3基因的表達得到有效抑制，從而調(diào)節(jié)了抗菌肽基因的表達，這說明GNBP3基因參與了家蠅先天性免疫應(yīng)答，在先天性免疫中有著至關(guān)重要的作用，可誘導(dǎo)抗菌肽基因的表達。白色念珠菌感染時，家蠅cecropins基因在GNBP3RNAi后的表達量顯著性降低(P<0.05)，diptericin基因在GNBP3RNAi后的表達量顯著性提高(P<0.05)，而家蠅defensin基因的表達在兩組間(GFPRNAi和GNBP3RNAi)差異不顯著(P>0.05)。大腸桿菌感染時，家蠅cecropins基因及家蠅diptericin基因在GNBP3RNAi后的表達量顯著性提高(P<0.05)，而家蠅defensin基因的表達在兩組間(GFPRNAi和GNBP3RNAi)差異不顯著(P>0.05)；金黃色葡萄球菌感染時，家蠅cecropins基因在GNBP3RNAi后的表達量顯著性提高(P<0.05)，而家蠅defensin基因及家蠅diptericin基因的表達在兩組間(GFPRNAi和GNBP3RNAi)差異不顯著(P>0.05)。GNBP3基因能夠激活Toll信號通路上游信號級聯(lián)傳遞，啟動下游抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄表達，使抗菌肽對微生物發(fā)揮查殺作用。通過對家蠅幼蟲GNBP3RNA干擾模型在微生物感染下，各抗菌肽基因表達情況的研究，發(fā)現(xiàn)白色念珠菌感染家蠅時cecropins基因低表達，說明沉默的GNBP3導(dǎo)致由β-1,3葡聚糖激活的Toll通路基因不能被激活，酚氧化物酶活性降低，不能啟動下游抗菌肽的應(yīng)答反應(yīng)，這說明家蠅GNBP3基因能夠識別真菌以啟動下游抗菌肽對真菌的查殺，在抗真菌免疫中起到一定作用。然而每種抗菌肽都有不同的活性譜，defensin一般情況下只對革蘭氏陽性菌起作用；diptericin對革蘭氏陰性菌有較強殺傷作用；cecropins對革蘭氏陽性和陰性菌都有廣譜的抗菌活性(Lietal., 2012; 羅嫚, 2017)，造成不同微生物感染狀態(tài)下各抗菌肽基因表達的差異性，白色念珠菌感染家蠅時diptericin基因高表達，大腸桿菌感染家蠅時cecropins及diptericin基因呈高表達，金黃色葡萄球菌感染家蠅時cecropins基因高表達，說明干擾GNBP3基因后并不能影響所有抗菌肽基因的表達反應(yīng)，可能同時存在其它抗菌途徑能夠誘導(dǎo)抗菌肽的產(chǎn)生，呈現(xiàn)協(xié)同調(diào)節(jié)的作用，共同完成家蠅先天性免疫系統(tǒng)對真菌的識別及免疫應(yīng)答，而對于家蠅先天性免疫系統(tǒng)對真菌的免疫應(yīng)答機制需進一步研究。此次研究將為今后家蠅先天性免疫系統(tǒng)對真菌的免疫應(yīng)答研究提供依據(jù)和參照，為進一步探討家蠅先天性免疫系統(tǒng)提供新的思路。