西方蜜蜂發(fā)育基因AmWnt1的克隆鑒定及時(shí)空表達(dá)分析

梁立強(qiáng)，郭永康，朱雅楠，李秋方，李正漢卿，王若虹，候夢(mèng)賞，龔 嬌，李 標(biāo)，曾何泉，聶紅毅，蘇松坤

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002)

Sharma等(1976)發(fā)現(xiàn)影響果蠅翅膀發(fā)育的關(guān)鍵基因wingless，由于該基因突變的果蠅成蟲表現(xiàn)出翅膀消失的特征，因此，wingless基因又稱為無翅基因。Nusse等(1982)發(fā)現(xiàn)了影響癌癥的關(guān)鍵基因int-1，該基因被小鼠乳腺腫瘤病毒激活后可以導(dǎo)致腫瘤。后來研究者發(fā)現(xiàn)小鼠int-1基因在果蠅中的同源基因就是wingless，因此把這類基因統(tǒng)一命名為Wnt基因，int-1(wingless)基因重新命名為Wnt1基因(Rijsewijketal., 1987; Nusseetal., 1991)。Wnt蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)閃nt1，富含半胱氨酸，屬于分泌型糖蛋白(Cadigan and Nusse, 1997)。Wnt基因分子功能在生物體中高度保守，從低等動(dòng)物的海葵到高等動(dòng)物的人類，基因組中均存在Wnt基因(Miller, 2001; Kusserowetal., 2005)。在人類和小鼠中，Wnt蛋白參與多種腫瘤發(fā)生、細(xì)胞命運(yùn)決定和內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等多種生命活動(dòng)，研究Wnt蛋白有利于人類進(jìn)一步了解癌癥的發(fā)生和細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化規(guī)律(Miller, 2001)。與脊椎動(dòng)物相比，昆蟲中很多Wnt家族基因發(fā)生了丟失(Muratetal., 2010)。目前已經(jīng)在鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、半翅目、膜翅目等多種昆蟲中系統(tǒng)的鑒定了Wnt基因家族成員，如家蠶Bombyxmori、果蠅Drosophilamelanogaster、岡比亞按蚊Anophelesgambiae、赤擬谷盜Triboliumcastaneum、豌豆蚜Acyrthosiphonpisum、西方蜜蜂基因組鑒定中分別鑒定了8、7、7、9、6、7個(gè)Wnt基因(Shigenobu, 2006; Bolognesietal., 2008; Shigenobu, 2010; Muratetal., 2010; Dingetal., 2019)。

在昆蟲中，果蠅的Wnt基因家族的生理功能研究最為深入。在果蠅中，Wnt1缺失會(huì)導(dǎo)致成蟲翅膀消失，還會(huì)引起胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受阻和胚胎體節(jié)分布異常等表型缺陷(Sharma and Chopra, 1976; Bejsovec, 2006)；DmWnt5基因功能較為復(fù)雜，該基因在顎節(jié)、腹神經(jīng)索、上唇、中胚層和肢體原基均有表達(dá)，且參與胚胎唾液腺遷移、中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突成術(shù)等生物學(xué)過程(Muratetal., 2010)；DmWnt7調(diào)控氣管發(fā)育、雄性生殖器官形成和唾液腺遷移等重要生理過程(Kozopasetal., 1998; Llimargas and Lawrence, 2001; Harris and Beckendorf, 2007)；高表達(dá)或低表達(dá)DmWnt8均會(huì)導(dǎo)致腹側(cè)內(nèi)凹受阻、背部表皮增加，并且DmWnt8突變還會(huì)導(dǎo)致免疫功能降低(Gordonetal., 2005)；DmWnt6只在胚胎和幼蟲腸道微弱表達(dá)；DmWnt10主要在3齡幼蟲的成蟲盤、胚胎的中胚層、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸道表達(dá)，且在3齡幼蟲的成蟲盤表達(dá)量較高(Jansonetal., 2001)。其它昆蟲關(guān)于Wnt家族研究主要集中在Wnt1基因。在家蠶中，利用CRISPR/Cas9敲除Wnt1后，突變體表現(xiàn)出胚胎孵化困難、足發(fā)育異常、無法著色和體節(jié)缺失等典型表型，并且還會(huì)導(dǎo)致ultrabithorax、abdominal-A、abdominal-B等HOX家族基因表達(dá)量急劇下調(diào)；對(duì)HOX基因進(jìn)一步敲除后，出現(xiàn)色素沉積和腹節(jié)分節(jié)異常等相似表型，表明BmWnt1可能通過調(diào)控家蠶HOX基因控制家蠶胚胎時(shí)期體節(jié)發(fā)育和幼蟲時(shí)期色素沉積(Zhangetal., 2015)。在乳草長(zhǎng)蝽Oncopeltusfasciatus中，通過RNA干擾敲低Wnt1基因的表達(dá)量，處理組出現(xiàn)眼睛變小和胚帶截?cái)嗟陌l(fā)育缺陷(Angelini and Kaufman, 2005)。在馬尾松毛蟲Dendrolimuspunctatus中，缺失Wnt1會(huì)導(dǎo)致色素分布異常、四肢缺失和頭部發(fā)育畸形等與家蠶BmWnt1突變體的相似表型(Liuetal., 2017)。在赤擬谷盜Triboliumcastaneum中，利用RNAi沉默TcWnt1基因的表達(dá)，導(dǎo)致了胚胎腹節(jié)邊界線、胸部附節(jié)、頜和側(cè)頭葉的缺失(Ober and Jockusch, 2006)。迄今為止，雖然已經(jīng)有研究者成功鑒定了西方蜜蜂的Wnt基因家族中的7個(gè)基因(Wnt1,Wnt4,Wnt5,Wnt6,Wnt7,Wnt10,Wnt11)(Dearden, 2006)，然而這些Wnt基因在西方蜜蜂中發(fā)揮的生理功能尚未報(bào)道?；赪nt1基因在果蠅、家蠶和赤擬谷盜等模式昆蟲胚胎發(fā)育過程中的重要作用，本研究克隆鑒定西方蜜蜂AmWnt1基因，并對(duì)該蛋白氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，同時(shí)利用熒光定量PCR檢測(cè)該基因在不同發(fā)育時(shí)期和剛出房工蜂不同組織的基因表達(dá)量，有利于為后續(xù)深入研究蜜蜂和其它膜翅目昆蟲Wnt1功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

西方蜜蜂樣品取自福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)。選擇群勢(shì)強(qiáng)、蜜粉充足且健康的1群作為試驗(yàn)蜂群。為了準(zhǔn)確收集不同發(fā)育時(shí)期的實(shí)驗(yàn)材料，利用限王產(chǎn)卵的方法控制蜂王產(chǎn)卵時(shí)間，主要步驟如下：利用方形王籠(72 mm × 51 mm)將蜂王控制在一張新巢脾上使之產(chǎn)卵，3 h后，取下限王框，待蜂王爬到巢脾另一處后，再次進(jìn)行限王產(chǎn)卵，3 h后重復(fù)以上步驟，直到收取足夠的實(shí)驗(yàn)材料。同時(shí)，準(zhǔn)確記錄每處限王的位置與相對(duì)應(yīng)的時(shí)間。當(dāng)胚胎分別發(fā)育至第1日齡(24 h)、2日齡(48 h)和3日齡(72 h)時(shí)，用小刀割下相對(duì)應(yīng)區(qū)域的巢脾，在顯微鏡下用不銹鋼移蟲針把卵收集至1.5 mL離心管中，用液氮浸泡20 s后，放置-80℃儲(chǔ)存；根據(jù)限王產(chǎn)卵時(shí)間，準(zhǔn)確收集幼蟲(1日齡、3日齡和5日齡)、預(yù)蛹(1日齡和3日齡)、蛹(0日齡、2日齡、4日齡、6日齡和8日齡)的材料。將封蓋子脾置于35℃培養(yǎng)箱中，每間隔 6 h收集出房的工蜂作為剛出房蜜蜂。將頭部插入幼蟲巢房中持續(xù)時(shí)間超過10 s的工蜂作為哺育蜂；在巢門口，抓取后足攜帶花粉團(tuán)的返巢工蜂作為采集蜂。在干冰上，分別解剖剛出房工蜂的頭、胸部、腹部、腸道、螫針、觸角、足和翅膀。每個(gè)采樣點(diǎn)(或組織)取3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)，采集的樣本用液氮浸泡20 s后，放置-80℃儲(chǔ)存，用于后續(xù)RNA提取。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

Trizol試劑、克隆載體pEASY-Blunt Zero、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1 Phage Resistant Competent cell、瓊脂糖、TAE緩沖液、Trans2K、6x Loading Buffer、GelStain染色劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix、HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司，切膠回收試劑盒Gel Extraction購(gòu)自O(shè)mega公司；LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司；RNA提取液購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

在NCBI網(wǎng)站下載西方蜜蜂AmWnt1mRNA序列(GenBank登錄號(hào)：XM_026444306.1)，用Primer 6.0設(shè)計(jì)用于克隆AmWnt1CDS序列和qRT-PCR的特異性引物(表1)。

1.3 AmWnt1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

1.3.1總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

將不同發(fā)育時(shí)期樣本和剛出房工蜂各組織分別充分研磨，按照Trizol試劑盒說明書方法提取RNA。取1 μg RNA為模板，參照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)說明書，合成cDNA的第1鏈。

1.3.2基因克隆與測(cè)序

將剛出房蜜蜂cDNA稀釋3倍后作為模板，以AmWnt1_c為引物，擴(kuò)增獲得AmWnt1基因的CDS序列。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×Phanta Max Buffer 25 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，dNTP Mix (10 mM each) 1 μL，上下游引物(10 μM)各2 μL，cDNA 5 μL，ddH2O14 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸1 min，循環(huán)數(shù)35；72℃終延伸，5 min。反應(yīng)結(jié)束后，按照Gel Extraction說明書進(jìn)行膠回收純化，產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，調(diào)整產(chǎn)物濃度為50 ng/μL。將純化后的PCR產(chǎn)物與Blunt Zero載體連接，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，送生物公司測(cè)序。

1.3.3生物信息學(xué)分析

BioEdit軟件預(yù)測(cè)AmWnt1基因編碼的氨基酸序列，ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)；分別利用NetPhos 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)、NetOGlyc 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)和NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測(cè)蛋白的N磷酸化位點(diǎn)、O糖基化位點(diǎn)和N糖基化位點(diǎn)；TMHMM-2.0 (http://www.cbs. dtu. dk/services/TMHMM/)分析跨膜結(jié)構(gòu)；ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)疏水性；SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽；SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域。用BioEdit和GENEDOC軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，通過MEGA 6.0軟件，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 西方蜜蜂AmWnt1基因在不同發(fā)育時(shí)期和剛出房工蜂各組織中表達(dá)量檢測(cè)

以1.4.1節(jié)反轉(zhuǎn)錄獲得的西方蜜蜂不同發(fā)育時(shí)期和剛出房工蜂各組織的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR。熒光定量PCR反應(yīng)(10 μL體系)：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (Low ROX Premixed) 5 μL，正反向引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)條件為95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)。按照如下條件測(cè)定熔解曲線：65℃升溫到95℃，每5 s升高0.5℃。反應(yīng)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)不同樣本的Ct值，用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。定量分析均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用SPASS 7.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用GraphPad Prism 6.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AmWnt1基因的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序

以剛出房蜜蜂的cDNA為模板，擴(kuò)增包含AmWnt1基因完整的CDS序列。PCR產(chǎn)物切膠純化后片段經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約1 500 bp處檢測(cè)到單一條帶，擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期(圖1)。該產(chǎn)物與Blunt zero載體連接，送生物公司測(cè)序。利用BioEdit軟件將測(cè)序的序列進(jìn)行拼接，去除載體序列，預(yù)測(cè)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(圖2)。與NCBI上預(yù)測(cè)的AmWnt1序列基本一致，CDS序列全長(zhǎng)為1 239 bp，編碼412個(gè)氨基酸。序列已上傳NBCI，登錄號(hào)為MT993937。

圖1 AmWnt1基因PCR產(chǎn)物切膠回收后的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of purified PCR product of AmWnt1 gene注：泳道M為DNA Marker DL 2000；泳道1為AmWnt1切膠回收純化后的PCR產(chǎn)物。Note: Lane M was DNA Marker DL 2000; Lane 1 was purified PCR product of AmWnt1 gene.

2.2 理化特性預(yù)測(cè)

通過ProtParam分析預(yù)測(cè)，AmWnt1蛋白等電點(diǎn)為9.48，分子量為46.40313 kDa，分子式為C1991H3158N630O579S38，共6 396個(gè)原子組成。脂肪指數(shù)為61.31，不穩(wěn)定指數(shù)為43.20，大于40，表明該蛋白不穩(wěn)定(Guruprasadetal., 1990)。不同氨基酸的占比不同，精氨酸含量最高，為9.5%(表2)。疏水性分析表明：AmWnt1蛋白第40位氨基酸得分最低為-2.978，第24位氨基酸得分最高為3.533，屬于親水性蛋白。

表2 西方蜜蜂AmWnt1蛋白的氨基酸種類和數(shù)目

圖2 西方蜜蜂AmWnt1基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequences of AmWnt1 of Apis mellifera注：劃線部分為Wnt1結(jié)構(gòu)域。Note: Wnt1 domain was underlined.

2.3 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明：AmWnt1蛋白在第73和第412個(gè)氨基酸之間有一個(gè)Wnt1結(jié)構(gòu)域，屬于Wnt家族成員。該蛋白無信號(hào)肽，共有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，位置為17～36，N端在細(xì)胞膜內(nèi)。AmWnt1蛋白包含12個(gè)O糖基化位點(diǎn)，位置分別為第6、72、76、172、175、179、180、181、292、294、296和298位氨基酸；共2個(gè)N糖基化位點(diǎn)，位置為第116、第358位氨基酸；磷酸化位點(diǎn)共有19個(gè)，其中1個(gè)酪氨酸位點(diǎn)、7個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和11個(gè)絲氨酸位點(diǎn)。

2.4 序列比對(duì)

通過在線軟件NCBI的BLASTP和BioEdit比對(duì)，與西方蜜蜂Wnt1蛋白同源度最高的物種為東方蜜蜂，相似度為99.50%；其次為小蜜蜂、歐洲熊蜂、切葉蜂、造紙胡蜂，相似度分別為99.26%、96.56%、97.24%、83.71%，表明Wnt1結(jié)構(gòu)域在膜翅目昆蟲中進(jìn)化的較為保守(圖3)。

圖3 西方蜜蜂AmWnt1氨基酸序列和其它膜翅目昆蟲同源序列比對(duì)Fig.3 Amino acid sequence alignment of AmWnt1 proteins from Apis mellifera and other Hymenoptera insects注：Wnt1蛋白來源及GenBank登錄號(hào)。AmWnt1：西方蜜蜂Apis mellifera，MT993937；AcerWnt1：東方蜜蜂Apis cerana，XP_016904766.1；AfloWnt1：小蜜蜂Apis florea，XP_031776435.1；BterWnt1：歐洲熊蜂Bombus terrestris，XP_003393164.1；MrotWnt1：切葉蜂Megachile rotundata，XP_003707885.1；PdomWnt1：造紙胡蜂Polistes dominula，XP_015178534.1。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用西方蜜蜂Wnt1蛋白氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行Blast檢索，得到包括膜翅目、蜚蠊目、雙翅目、直翅目、鱗翅目和鞘翅目等16種昆蟲Wnt1蛋白的氨基酸序列，將各種昆蟲的氨基酸序列導(dǎo)入到MEGA 6.0進(jìn)行序列比對(duì)，然后利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示：膜翅目、鞘翅目和鱗翅目分別單獨(dú)聚為一個(gè)分支，但雙翅目的埃及伊蚊和黑腹果蠅，分別與蜚蠊目的美洲大蠊和直翅目的雙蟋蟀聚為一群，置信度分別為50和38。西方蜜蜂Wnt1蛋白與膜翅目東方蜜蜂親緣關(guān)系最近，與鞘翅目赤擬谷盜親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖4)。

圖4 基于西方蜜蜂和其它昆蟲Wnt1氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Wnt1 from Apis mellifera and insects reconstructed based on amino acid sequences注：Wnt1蛋白來源及對(duì)應(yīng)的GenBank登錄號(hào)AmWnt1：西方蜜蜂Apis mellifera，MT993937；AcerWnt1：東方蜜蜂Apis cerana，XP_016904766.1；AfloWnt1：小蜜蜂Apis florea，XP_031776435.1；BterWnt1：歐洲熊蜂Bombus terrestris，XP_003393164.1；MrotWnt1：切葉蜂Megachile rotundata，XP_003707885.1；PdomWnt1：造紙胡蜂Polistes dominula，XP_015178534.1；LhumWnt1：阿根廷螞蟻Linepithema humile，XP_012229142.1；SinvWnt1：紅火蟻Solenopsis invicta，XP_025994453.1；NvitWnt1：金小蜂Nasonia vitripennis，XP_001603388.3；PaneWnt1：美洲大蠊Periplaneta Americana，AGG14205.1；AaegWnt1：埃及伊蚊Aedes aegypti，XP_021702999.1；DmelWnt1：黑腹果蠅Drosophila melanogaster，NP_523502.1；GbimWnt1：雙蟋蟀Gryllus bimaculatus，BAB19660.1；TcasWnt1：赤擬谷盜Tribolium castaneum，EFA04660；PxylWnt1：小菜蛾P(guān)lutella xylostella，XP_011568230.1；BmorWnt1：家蠶Bombyx mori，NP_001037315.1；HarmWnt1：棉鈴蟲Helicoverpa armigera，AHN95659.1。

2.6 AmWnt1基因表達(dá)量分析

采用熒光定量PCR獲得AmWnt1基因在不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量(圖5)。結(jié)果表明：AmWnt1基因在西方蜜蜂各個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)。在胚胎期，該基因在1日齡胚胎中表達(dá)量較低，隨著胚胎的發(fā)育，表達(dá)量持續(xù)增加，且在3日齡胚胎時(shí)該表達(dá)量達(dá)到整個(gè)發(fā)育時(shí)期的最大值；幼蟲階段，該基因表達(dá)量相對(duì)較低；在預(yù)蛹期，該基因的表達(dá)量顯著升高；在蛹期，該基因在0日齡的蛹的表達(dá)量繼續(xù)增加，呈現(xiàn)第二個(gè)峰值的趨勢(shì)，然后表達(dá)量逐漸降低。AmWnt1基因在剛出房蜜蜂不同組織的表達(dá)譜表明：AmWnt1基因在剛出房蜜蜂頭、胸、腹、腸道、翅膀、蟄針、觸角、足中均有表達(dá)，其中在胸部、頭、觸角中高表達(dá)(圖6)。

圖5 AmWnt1基因在西方蜜蜂不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of AmWnt1 in different developmental stages of Apis mellifera注：E1-3，分別是1～3日齡卵；L1，L3，L5分別為第1天、3天和5天的幼蟲；PP1，1日預(yù)蛹；P0，P2，P4，P6，P8分別為第0，2，4，6,8日齡的蛹；NE，剛出房工蜂；Nur，哺育蜂；For，采集蜂。圖中數(shù)據(jù)表示平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤，不同字母代表不同發(fā)育時(shí)期AmWnt1相對(duì)表達(dá)量具有顯著性差異(P<0.05，Dunnett’s T3檢驗(yàn))。Note: E1-3， 1～3-day-old egg, respectively; L1, L3, L5， larvae of 1-day-old, 3-day-old and 5-day-old, respectively; PP1， 1-day-old pharate pupae; P0, P2, P4, P6, P8， pupae of 0-day-old, 2-day-old, 4-day-old, 6-day-old, 8-day-old, respectively; NE， Newly emerged workers; Nur， Nurse bees; For， Foragers. Data in the figure were mean±SE, different letters indicated significant differences among different developmental stages (P<0.05, Dunnett’s T3 test).

圖6 AmWnt1基因在剛出房工蜂不同組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression levels of AmWnt1 in different tissues of newly emerged workers注：He，頭(去觸角)；Th，胸(去翅膀和足)；Ab，腹(去腸道)；An，觸角；Wing，翅膀；Gut，腸道；St，蟄針(帶毒腺)；Le，足leg。不同字母代表不同組織中AmWnt1相對(duì)表達(dá)量具有顯著性差異(P<0.05, Dunnett’s T3檢驗(yàn))。Note: He， head (without antenna); Th， thorax (without wing and legs); Ab， abdomen (with gut removed); An， antenna; Wing， wing; Gut， gut; St， sting (with venom gland); Le， leg. Different letters indicated significant differences among different tissues (P<0.05, Dunnett’s T3 test).

3 結(jié)論與討論

AmWnt1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，與已經(jīng)報(bào)道的Wnt蛋白一致，AmWnt1蛋白具有保守的Wnt1結(jié)構(gòu)域(位于第73位到第412位氨基酸)。研究者認(rèn)為，Wnt基因編碼分泌型糖蛋白，而多數(shù)分泌型蛋白在N端具有信號(hào)肽(Cadigan and Nusse, 1997; Zhao, 2006)。根據(jù)SignalP 4.1信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果，AmWnt1蛋白并未預(yù)測(cè)到信號(hào)肽。Ding等(2019)研究表明，在果蠅、家蠶、赤擬谷盜、岡比亞按蚊等模式昆蟲中均可預(yù)測(cè)到Wnt1蛋白的信號(hào)肽序列，在小菜蛾P(guān)lutellaxylostella和黑脈金斑蝶Danausplexippus未預(yù)測(cè)到信號(hào)肽；與此同時(shí)，家蠶Wnt8和Wnt10蛋白未檢測(cè)到信號(hào)肽，可能是這些蛋白包含隱藏部分的信號(hào)肽序列，使得SignalP 4.1軟件無法識(shí)別，西方蜜蜂AmWnt1蛋白可能也因此無法檢測(cè)到信號(hào)肽。

AmWnt1在西方蜜蜂不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，在胚胎期、預(yù)蛹期、蛹前期表達(dá)量高于其它時(shí)期，尤其隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行，表達(dá)量逐漸升高，并達(dá)到峰值。Zhang等(2015)檢測(cè)了BmWnt1在家蠶胚胎期的表達(dá)量，該基因在胚胎發(fā)育前期的表達(dá)量高于后期。在西方蜜蜂中，AmWnt1在西方蜜蜂胚胎發(fā)育后期表達(dá)量最高，暗示AmWnt1可能主要參與胚胎的晚期發(fā)育。西方蜜蜂胚胎發(fā)育過程包括卵裂、胚盤形成與發(fā)育(7～33 h)、原腸胚形成(33～40 h)、胚帶形成(40～55 h)和背部發(fā)育等5個(gè)過程，3日齡卵AmWnt1基因表達(dá)量最高，此時(shí)正處于胚帶形成階段，這個(gè)階段主要發(fā)生卵膜、羊膜、中腸、神經(jīng)系統(tǒng)和其它外胚層結(jié)構(gòu)的形成(Fleig and Sander, 1986)，AmWnt1可能參與調(diào)控其中一種或多種組織的形成，并且已有研究證明在果蠅Wnt1突變體中，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常(Chu-LaGraff and Doe, 1993)。2日齡卵AmWnt1基因表達(dá)量?jī)H次于3日齡卵，此時(shí)處于胚盤形成與發(fā)育階段。敲除家蠶、馬尾松毛蟲Wnt1基因，幼蟲均會(huì)出現(xiàn)四肢和腹節(jié)缺失、色素分布異常等發(fā)育缺陷(Zhangetal., 2015; Liuetal., 2017)；在西方蜜蜂中，四肢出現(xiàn)發(fā)生在蛹期前期，此時(shí)AmWnt1表達(dá)量處于第二個(gè)高峰期，猜測(cè)可能參與此時(shí)的四肢發(fā)育過程。熒光定量PCR結(jié)果表明：AmWnt1基因在剛出房工蜂頭部的表達(dá)量高于其它組織，這與Wnt1基因在家蠶3日5齡幼蟲頭部高表達(dá)的結(jié)果是一致的(Dingetal., 2019)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，AmWnt1與同屬膜翅目昆蟲Wnt1聚為一支，其中與東方蜜蜂親緣關(guān)系最近，表明Wnt1蛋白在膜翅目昆蟲之間進(jìn)化的較為保守。在雙翅目、鱗翅目和鞘翅目中，Wnt1基因功能已經(jīng)研究的較為明晰，然而目前還沒有關(guān)于膜翅目昆蟲Wnt1基因相關(guān)報(bào)道。本研究首次在膜翅目昆蟲中克隆鑒定了AmWnt1基因，明確了該基因在不同發(fā)育階段和剛出房蜜蜂的不同組織的表達(dá)特征，推測(cè)其可能參與了西方蜜蜂胚胎晚期的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和化蛹過程中的四肢發(fā)育等關(guān)鍵歷程，為膜翅目其它昆蟲Wnt1基因的研究提供了參考。在蜜蜂中研究發(fā)育相關(guān)基因，也將為膜翅目寄生蜂的生物防控提供理論參考。

近年來，隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的日漸成熟，越來越多的運(yùn)用于昆蟲的基因功能研究中。在西方蜜蜂中，已經(jīng)成功運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功敲除了mrjp1，mKast，pax6，doublesex，fruitless，feminizer和loc552773等6個(gè)基因(Kohnoetal., 2016; Kohno and Kubo, 2018; Huetal., 2019; Rothetal., 2019)。下一步，我們將會(huì)借助于本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)建立的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建AmWnt1突變體，進(jìn)一步驗(yàn)證該基因在蜜蜂發(fā)育和行為中的功能，為驗(yàn)證Wnt家族的其它基因提供技術(shù)參考，為研究膜翅目其它昆蟲的Wnt1基因功能奠定基礎(chǔ)。