包裝飲用水中銅綠假單胞菌生長曲線及其快速檢測

◎ 覃 宇，向麗萍，吳金春，王 奧，任道援，張祖文

（遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，貴州 遵義 563000）

銅綠假單胞菌作為一種對生長環(huán)境要求極低的致病菌，其繁殖能力極強，具有很強的耐藥性，廣泛存在于日常生活中，屬于條件致病菌，會引發(fā)一系列疾病[1]。因此，對于該菌的科學(xué)研究及其重要。國內(nèi)外對于該菌的研究主要有耐藥性研究、致病因子研究、遺傳物質(zhì)研究等，而對于該菌的基礎(chǔ)性研究比較少。本次研究是從包裝飲用水這一日常生活中的必需品著手，研究銅綠假單胞菌在其中的生長情況及探討一種快速確定其濃度的方法[2]，得到吸光度值與菌落數(shù)成反比[3]。使用此法可快速確定菌懸液中銅綠假單胞菌菌落數(shù)，對于后續(xù)開展相關(guān)試驗可明顯縮短試驗時間，加快試驗進程，也填補了銅綠假單胞菌基礎(chǔ)性研究的空白。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要耗材

銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)seudomonas aeruginosa（ATCC 9027)、假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN瓊脂、金氏B培養(yǎng)基、乙酰胺液體培養(yǎng)基、綠膿菌素測定用培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、氧化酶試劑、鈉氏試劑和一次性接種環(huán)均購于廣州陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。試驗所用培養(yǎng)基需121 ℃滅菌15 min后使用；革蘭氏陰性鑒定卡（GN卡）采購于梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2 主要設(shè)備

VITEK?2 compact全自動微生物分析系統(tǒng)（梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司）、生物安全柜（蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司）、隔水式培養(yǎng)箱（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、全自動立式壓力滅菌器（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）和紫外分光光度計（北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 繪制銅綠假單胞菌生長曲線

用一次性接種環(huán)挑取一環(huán)實驗室保存銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（編號ATCC 9027）污染自超市采購的經(jīng)檢測無菌落生長的5 L裝包裝飲用水（同一批次購買2瓶），在20 ℃下放置30 d，且在放置過程中，在其生長曲線的穩(wěn)定期，吸取1 mL加入至另一瓶包裝飲用水中，在4 ℃下放置35 d（在污染之前，每桶水分別取500 mL在各個溫度下放置，留作空白對照），根據(jù)其在水中的銅綠假單胞菌的菌落數(shù)變化繪制生長曲線。

（1）標(biāo)準(zhǔn)菌株活化。將保存于-70 ℃超低溫冰箱的銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株磁珠管取出放入4 ℃冰箱，讓其磁珠溫度升高。提前制備營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，在超凈工作臺下完成以下步驟：用接種針挑取磁珠，在營養(yǎng)瓊脂上劃線，36 ℃下培養(yǎng)24 h。待營養(yǎng)瓊脂上生長出銅綠假單胞菌單菌落后，開始下一步驟。

（2）操作步驟及培養(yǎng)。不同溫度下保的試驗樣品，每間隔一段時間，從中吸取1 mL加入無菌培養(yǎng)皿中，倒入已滅菌的假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN瓊脂，然后在36 ℃下培養(yǎng)48 h，然后計數(shù)，繪制生長曲線。

1.3.2 分光光度計法快速測定銅綠假單胞菌菌懸液濃度

（1）標(biāo)準(zhǔn)菌株活化，與1.3.1步驟相同。

（2）制備菌懸液。將上一步驟生長的銅綠假單胞菌單菌落加入裝有3 mL濃度0.45%的無菌生理鹽水中，用濁度儀調(diào)整其麥?zhǔn)蠞岫葹? MCF（其中細菌濃度約為3×108CFU·mL-1），備用。

（3）測定吸光度值。取1 mL制備的麥?zhǔn)蠞岫葹? MFC的菌懸液（其濃度約為3×108CFU·mL-1）加入到4 mL無菌生理鹽水中，此時菌懸液被稀釋5倍，其菌懸液濃度約為 0.6×108CFU·mL-1；將 0.6×108CFU·mL-1菌懸液取1 mL加入到9 mL生理鹽水中，此時菌懸液被稀釋10倍，菌懸液濃度約為0.6×107CFU·mL-1；以同樣的方式，依次做梯度稀釋，稀釋度至菌懸液濃度約為0.5×102CFU·mL-1；用紫外可見光分光光度計在波長600 nm下測定不同稀釋度的吸光度值[4]。

（4）測定菌落數(shù)。在超凈工作臺上用1 mL移液管吸取上一步驟中不同稀釋度的菌懸液至無菌平皿中，每個稀釋度做雙平行。同時做生理鹽水空白和培養(yǎng)基空白。適時導(dǎo)入合適溫度的平板計數(shù)瓊脂，待瓊脂凝固后倒置培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱中36 ℃，培養(yǎng)48 h，計數(shù)每個稀釋度菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌生長曲線結(jié)果與分析

2.1.1 結(jié)果

20 ℃下銅綠假單胞菌生長曲線圖如圖1所示。由圖1可知，銅綠假單胞菌生長穩(wěn)定期在第4～6 d。在其菌生長的穩(wěn)定期，吸取1 mL加入包裝飲用水中，4 ℃下放置35 d，其試驗樣品結(jié)果生長曲線如圖2所示。

圖1 20 ℃銅綠假單胞菌生長曲線圖

圖2 4 ℃放置35 d銅綠假單胞菌生長曲線圖

2.1.2 分析

由試驗結(jié)果可知，銅綠假單胞菌對于生長環(huán)境要求不高，但其對溫度特別敏感。在20 ℃下，其生長曲線包含細菌的4個生長時期：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。其穩(wěn)定期為放置的第4～6 d，此期間其菌落數(shù)無變化，無其他干預(yù)手段，整個生長周期在30 d左右。但在4 ℃下，該菌基本不生長，菌落數(shù)一直呈現(xiàn)下降趨勢，這也可以解釋在冬天溫度較低時，部分包裝飲用水企業(yè)銅綠假單胞菌檢出率不高的現(xiàn)象。

2.2 吸光度值與銅綠假單胞菌關(guān)系的結(jié)果與分析

2.2.1 結(jié)果

不同菌懸液濃度銅綠假單胞菌菌落數(shù)結(jié)果與對應(yīng)的吸光度值見表1。由表1可知，當(dāng)稀釋度較高時吸光度值趨近于0。當(dāng)銅綠假單胞菌菌落數(shù)在2.95×105CFU·mL-1，吸光度值為0.004，之后其吸光度值才開始呈現(xiàn)規(guī)律性變化。

表1 銅綠假單胞菌菌落數(shù)及吸光度值表

以銅綠假單胞菌菌落數(shù)為2.95×105CFU·mL-1、2.75×106CFU·mL-1、8.75×106CFU·mL-1、2.95×107CFU·mL-1和 4.75×107CFU·mL-1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。以菌落數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，其相關(guān)系數(shù)達到0.997 8。

2.2.2 分析

由試驗結(jié)果可知，當(dāng)銅綠假單胞菌菌落數(shù)在2.95×105CFU·mL-1及以上時，其吸光度值變化明顯，可以用紫外分光光度計測定其菌懸液中菌落數(shù)；而低于此菌落數(shù)時，其吸光度值變化不明顯，當(dāng)吸光度值趨近于零時不適用于紫外分光光度計法。因此，當(dāng)銅綠假單胞菌落數(shù)需要快速得出時，且菌落數(shù)大于2.95×105CFU·mL-1或吸光度值在0.04及以上時，可以用紫外分光光度計法快速測出其菌懸液中菌落數(shù)，此時吸光度值與銅綠假單胞菌菌落數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)，其R2=0.997 8。

圖3 銅綠假單胞菌菌落數(shù)與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3 結(jié)論與討論

通過繪制銅綠假單胞菌在包裝飲用水中的生長曲線可知：銅綠假單胞菌極易存活，當(dāng)水廠被污染后難以徹底殺滅。若無其他干預(yù)手段，其生長周期在30 d左右。銅綠假單胞菌對生長溫度極其敏感，可考慮從溫度入手，再配合適宜消毒劑，殺滅該菌。繪制銅綠假單胞菌生長曲線，認(rèn)識其在包裝飲用水中生長規(guī)律將會幫助繼續(xù)開展相關(guān)研究，也可以讓飲用水廠更直觀的了解該菌的生長情況。

通過用紫外分光光度計法測定銅綠假單胞菌菌懸液中菌落數(shù)和吸光值度值之間的關(guān)系可知，當(dāng)菌懸液濃度較低或測出其吸光度值較低時，不適用于紫外分光光度計法。麥?zhǔn)媳葷岱A(yù)測濁度為1.0 MFC時，銅綠假單胞菌菌落數(shù)為3.45×108CFU·mL-1，與預(yù)估的菌落數(shù)值存在差距，其繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2=0.997 8，說明不同細菌種類大小和形態(tài)都有區(qū)別。

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》（GB 19298—2014）產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定包裝飲用水不得檢出銅綠假單胞菌[5]?，F(xiàn)階段對于該菌的殺滅方式主要是以消毒劑的方式對水廠區(qū)域及成品水進行消毒，通過上述該菌的生長曲線及與吸光度值關(guān)系兩個方面的研究，當(dāng)水廠區(qū)域環(huán)境及生產(chǎn)環(huán)節(jié)溫度較低時，使用消毒劑消毒，可以達到更好的殺滅效果。而通過吸光度值與銅綠假單胞菌菌落數(shù)的關(guān)系，可以快速確定包裝飲用水中該菌的菌落數(shù)含量。