市售三明治微生物檢測(cè)結(jié)果分析

◎ 楊 嘉，丁娟芳，何旭東，呂 晴，鄒勇平

（1.揚(yáng)州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué) 生物與化工工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000）

三明治類(lèi)糕點(diǎn)屬于冷加工糕點(diǎn)中的夾心類(lèi)糕點(diǎn)，一般含有新鮮水果蔬菜等組分，并以散裝形式進(jìn)行出售。受“輕食主義”和鮮食蔬菜潮流影響，三明治類(lèi)糕點(diǎn)既能滿(mǎn)足低熱量、低脂、高纖維膳食的健康需求和年輕消費(fèi)群體的時(shí)尚優(yōu)越感，又能順應(yīng)現(xiàn)代都市的快節(jié)奏生活，逐漸成為各糕點(diǎn)門(mén)店的高銷(xiāo)量明星產(chǎn)品。

三明治作為冷加工類(lèi)糕點(diǎn)在加工過(guò)程中會(huì)添加沙拉醬、奶油等輔料及未經(jīng)加熱處理的鮮食蔬菜等組分，同時(shí)三明治的后期生產(chǎn)過(guò)程主要依賴(lài)手工制作，原料帶入、人員操作、制作工器具和生產(chǎn)環(huán)境等均可能給產(chǎn)品帶來(lái)微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，由三明治引起的食品安全事件也常有報(bào)道[1-3]。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)揚(yáng)州市流通領(lǐng)域三明治類(lèi)糕點(diǎn)中的致病菌進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)三明治不同組分中微生物的短期變化情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤，旨在為三明治類(lèi)糕點(diǎn)的食品安全監(jiān)管及生產(chǎn)管理改進(jìn)提供依據(jù)。

（2）頒布專(zhuān)項(xiàng)法規(guī)。針對(duì)煤礦關(guān)閉，各國(guó)均頒布了專(zhuān)項(xiàng)法律法規(guī)，并成立專(zhuān)門(mén)機(jī)構(gòu)，處理煤礦關(guān)閉的各項(xiàng)問(wèn)題。在國(guó)內(nèi)，由于區(qū)分不嚴(yán)格，缺乏相應(yīng)的專(zhuān)項(xiàng)法律，沒(méi)有清晰的安置規(guī)定，易出現(xiàn)員工期望過(guò)高和安置政策的沖突。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

在揚(yáng)州市的流通領(lǐng)域通過(guò)購(gòu)買(mǎi)采集到三明治類(lèi)糕點(diǎn)共計(jì)18個(gè)品種，產(chǎn)品標(biāo)識(shí)均為當(dāng)日生產(chǎn)。

如表2所示，2021年9月7日發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31607—2021中對(duì)“部分或未經(jīng)熱處理的散裝即食食品”的致病菌限量進(jìn)行了規(guī)定，本實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)自非餐飲服務(wù)類(lèi)的流通門(mén)店，涉及的致病菌檢測(cè)結(jié)果均滿(mǎn)足該標(biāo)準(zhǔn)限量要求。

1.教學(xué)理念的轉(zhuǎn)變不到位。遙感課程分為理論和實(shí)踐兩部分。講授理論時(shí)，往往是教師在講臺(tái)上講，學(xué)生在座位上聽(tīng)；傳授實(shí)踐時(shí)，一般是教師先演示，然后學(xué)生模仿。這種“教師先引導(dǎo)+學(xué)生被動(dòng)機(jī)械接受”的傳遞式教學(xué)模式使教師經(jīng)常按照自己的見(jiàn)解解釋知識(shí)和現(xiàn)象，唯恐學(xué)生不懂，往往面面俱到，但是忽略了學(xué)生的感悟和體驗(yàn)，制約了學(xué)生的發(fā)散思維，無(wú)法調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性。

乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；甲酸（色譜純，美國(guó)ACS恩科化學(xué)公司）；三氟乙酸乙腈水溶液（50∶2.5∶47.5，V∶V∶V，色譜純，美國(guó)Honeywell公司）；基質(zhì)溶液（α-氰基-4-羥基肉桂酸，HCCA，德國(guó)Bruker公司）。

1.3.2 不同組分中微生物的短期變化情況動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目為菌落總數(shù)、大腸菌群和霉菌酵母。樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室當(dāng)天將三明治不同組分按照實(shí)際檢驗(yàn)量要求分別取5份平行樣品，全部記錄取樣量后置于無(wú)菌容器內(nèi)在2～8 ℃條件下冷藏保存。將不同組分樣品分別在第1 d、第3 d、第5 d、第7 d和第9 d參照國(guó)標(biāo)方法《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》（GB 4789.2—2016）、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB 4789.3—2016）第二法和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）第一法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)樣品量可偏離標(biāo)準(zhǔn)按照實(shí)際情況進(jìn)行逐級(jí)稀釋處理得到1∶10、1∶100等不同濃度樣品勻液。

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（Crystal Violet Neutral Red Bile Salt Agar，VRBA）培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽（Brilliant Green Lactose Bile Salt，BGLB）肉湯、Baird-Parker培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯（Brain Heart Infusion Broth，BHI）、凍干血漿、血瓊脂平板、緩沖蛋白胨水、四硫磺酸鈉煌(Tetrathionate Brilliant Green Enrichment Medium Base，TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（Selenite Cystine Broth，SC）增菌液、亞硫酸鉍（Bisulfite Sulfite Agar，BS）瓊脂、沙門(mén)顯色培養(yǎng)基、木糖賴(lài)氨酸脫氧膽鹽（Xylose Lysine Deoxycholate Agar，XLD）瓊脂、HE瓊脂、李氏增菌肉湯 LB（LB1，LB2）、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、PALCAM平板、甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂(Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar，MYP)平板、改良山梨醇麥康凱（CT-SMAC）平板、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG（MUG-LST）及大腸埃希氏菌O157顯色平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；FC-08拍打式均質(zhì)器（杭州賽普科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；BIO II ADVANCE PLUS 4生物安全柜（西班牙Telstar公司）；SQ510C滅菌鍋（日本YAMATO公司）；IC413C高溫恒溫式培養(yǎng)箱（日本YAMATO公司）；MJX-250B-Z霉菌培養(yǎng)箱、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；ECLIPSE生物顯微鏡（日本尼康公司）；Microflex LT/SH基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker公司）。

圖6表示不同業(yè)務(wù)量情況下，采用傳統(tǒng)二進(jìn)制退避BEB算法和DOB算法的系統(tǒng)吞吐量.由圖6可知，DOB算法不僅使系統(tǒng)飽和吞吐量平均增加一倍，其飽和時(shí)業(yè)務(wù)量閾值也大于BEB算法.在網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)N=6時(shí)，BEB算法的業(yè)務(wù)量時(shí)就達(dá)到飽和吞吐量0.0917.而改進(jìn)后的DOB算法在左右時(shí),系統(tǒng)才達(dá)到飽和狀態(tài)，且飽和吞吐量為0.172，較BEB算法提升了0.08.綜上研究表明，DOB算法的系統(tǒng)平均接入時(shí)延和吞吐量較BEB算法有較大的改善，且隨著網(wǎng)絡(luò)業(yè)務(wù)量的增加，達(dá)到飽和吞吐量時(shí)業(yè)務(wù)量的閾值大小也較BEB算法有所提高.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 致病菌檢測(cè)

致病菌檢測(cè)項(xiàng)目為金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸埃希氏菌O157。樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室當(dāng)天從含有三明治全部組分的縱切面進(jìn)行取樣，取樣時(shí)的組分比例盡量和縱切面比例保持一致。金黃色葡萄球菌按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）第二法進(jìn)行檢測(cè)，沙門(mén)氏菌按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）進(jìn)行檢測(cè)，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.30—2016）第一法進(jìn)行檢測(cè)，蠟樣芽孢桿菌按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》（GB 4789.14—2014）第一法進(jìn)行檢測(cè)，大腸埃希氏菌O157按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)》（GB 4789.36—2016）第一法進(jìn)行檢測(cè)。

校級(jí)仿真實(shí)驗(yàn)室建設(shè)應(yīng)由廳級(jí)主管部門(mén)主持協(xié)調(diào)，定位于地區(qū)、省內(nèi)甚至省間共享。將各學(xué)科基礎(chǔ)性、專(zhuān)業(yè)性實(shí)驗(yàn)統(tǒng)籌安排、統(tǒng)一開(kāi)發(fā)，避免低層次重復(fù)建設(shè)，節(jié)約資源。重點(diǎn)放在特色實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的研發(fā)方面。

2013年，公司緊緊抓住國(guó)家水利改革發(fā)展的機(jī)遇，狠抓內(nèi)部管理，積極提質(zhì)增效。經(jīng)過(guò)全體員工努力，全年實(shí)現(xiàn)銷(xiāo)售額近4億元，銷(xiāo)售量3萬(wàn)多t，參加各種招標(biāo)投標(biāo)200多次，中標(biāo)100多個(gè)工程，數(shù)量達(dá)2萬(wàn)多t。公司售后人員參與近百個(gè)工程項(xiàng)目的安裝指導(dǎo)工作。

根據(jù)評(píng)分制追蹤陰道分娩結(jié)局，規(guī)范剖宮產(chǎn)術(shù)后經(jīng)陰道分娩（VBAC），降低再次剖宮產(chǎn)率，降低母體并發(fā)癥及死亡率，有著十分重要的社會(huì)效應(yīng)和經(jīng)濟(jì)效益。建立適合我國(guó)國(guó)情的疤痕子宮再次妊娠經(jīng)陰道分娩的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分制預(yù)測(cè)公式，將為降低我國(guó)的剖宮產(chǎn)率及母兒圍生期疾病奠定基礎(chǔ)，面對(duì)國(guó)內(nèi)VBAC剛剛起步的現(xiàn)狀，做好VBAC管理和規(guī)范，采取個(gè)體化全面評(píng)估，有利于推動(dòng)VBAC在我國(guó)的普及。

1.3.3 菌種鑒定方法

本次采集的三明治樣本組分可拆解為面包部分、鮮食蔬菜部分（包括生菜、黃瓜、西紅柿）、肉類(lèi)部分（包括雞排、雞腿肉、雞柳、火腿片、培根、香腸片、肉松和午餐肉）、蛋類(lèi)部分（包括煎蛋、滑蛋、切蛋片、蛋泥）、醬類(lèi)部分（包括芝士醬、沙拉醬、金槍魚(yú)醬和青瓜醬）及其他熟制部分（玉米粒、醬黃瓜片）。實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同組分的菌落總數(shù)、大腸菌群和霉菌酵母進(jìn)行了一周（第1 d、3 d、5 d、7 d和9 d）的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）中的項(xiàng)目要求和相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[1-3,5-7]對(duì)流通領(lǐng)域采集到的三明治類(lèi)糕點(diǎn)中的金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸埃希氏菌O157進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示，18個(gè)品種的三明治中均未檢出沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和大腸埃希氏菌O157；3個(gè)品種三明治中檢出金黃色葡萄球菌（含量均為10 CFU·g-1），1個(gè)品種三明治中檢出蠟樣芽孢桿菌（含量為20 CFU·g-1）。

表1 致病微生物檢測(cè)結(jié)果表

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

表2 部分或未經(jīng)熱處理的散裝即食食品的致病菌限量值表

2.2 不同組分微生物的變化情況監(jiān)測(cè)結(jié)果

動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)中分離得到的部分菌株活化2代后以基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）方法進(jìn)行鑒定[4]。挑取少量純化后的菌株新鮮培養(yǎng)物涂抹于靶板上，在靶位中形成均勻涂層，自然干燥。在菌落涂層上直接覆蓋1 μL 70%的甲酸溶液，干燥后覆蓋1 μL基質(zhì)溶液，自然干燥后放入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果與儀器自帶數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后形成分值，鑒定分值在2.00及以上為滿(mǎn)足種鑒定。

監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，鮮食蔬菜的菌落總數(shù)初始檢出值和增殖速度在動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)周期內(nèi)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他組成部分。以三明治中的鮮食生菜為例，初始菌落檢出值在105～106CFU·g-1，并且在監(jiān)測(cè)周期內(nèi)增殖明顯，第9 d最高檢出值可到達(dá)1011CFU·g-1。隨機(jī)挑取20株分離自生菜的細(xì)菌單菌落，接種平板計(jì)數(shù)瓊脂，純化后以MALDI-TOF-MS方法進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果顯示20株細(xì)菌可歸于3個(gè)屬，假單胞菌屬（Pseudomonas）共計(jì)10株，其中杰森假單胞菌（Pseudomonas jessenii）3株、青草假單胞菌（Pseudomonas graminis）4株、黎巴嫩假單胞菌（Pseudomonas libanensis）3株；泛菌屬（Pantoea）共計(jì)9株，其中菠蘿泛菌（Pantoea ananatis）5株、成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）4株；腸桿菌屬（Enterobacter）共計(jì)1株，為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）。

除鮮食蔬菜外，其他組分的初始菌落檢出值均不超過(guò)104CFU·g-1，其中來(lái)源于預(yù)包裝食品的組分（如醬類(lèi)部分）菌落總數(shù)檢出值都在102CFU·g-1以下，且在保存過(guò)程中細(xì)菌增殖緩慢，推測(cè)是原組分中的防腐成分在持續(xù)抑制著微生物的增殖。熟制加工的肉類(lèi)部分初始菌落最高檢出值為103CFU·g-1，但隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，部分肉類(lèi)所含微生物會(huì)有一定程度增殖，第9 d最高檢出值可達(dá)105CFU·g-1，其增殖速度小于鮮食蔬菜組分。對(duì)同類(lèi)組分菌落總數(shù)檢出值進(jìn)行橫向比較表明，食材的操作復(fù)雜程度越高，則菌落總數(shù)檢出值越易偏高。以蛋類(lèi)部分為例，煎蛋的主要操作是油煎，操作簡(jiǎn)單且經(jīng)過(guò)高溫處理，菌落總數(shù)檢出值均在102CFU·g-1以下?；耙话闶怯缅侒w余溫煎至近熟，切蛋片需要將水煮蛋脫殼后切片處理，而蛋泥需要將水煮蛋脫殼后用刀叉等工具搗碎后放入沙拉醬等調(diào)味料進(jìn)行混勻攪拌。滑蛋、切蛋片和蛋泥的菌落總數(shù)檢出值普遍高于煎蛋，其中一份蛋泥樣本的初始最高檢出值達(dá)到了 104CFU·g-1。

三明治各組分的大腸菌群初始檢出值較低，在保存過(guò)程中增殖不明顯，推測(cè)由于初始基數(shù)不高，在與其他微生物的競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中不占優(yōu)勢(shì)。所有三明治組分的霉菌酵母初始檢出值均小于10 CFU·g-1，但部分樣品在保存至第5 d時(shí)陸續(xù)檢出了酵母菌，第9 d最高檢出值達(dá)到了103CFU·g-1。檢出酵母菌的三明治組分全部來(lái)自一家生產(chǎn)廠家，推測(cè)在生產(chǎn)環(huán)境中含有酵母芽孢，在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)污染產(chǎn)品，并在保存后期開(kāi)始增殖生長(zhǎng)。所分離得到的酵母菌經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定均為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），不存在相關(guān)食用風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論與討論

三明治等冷加工糕點(diǎn)由于工藝原因易受到微生物污染，已報(bào)道分離自三明治的致病菌有沙門(mén)氏菌[1-3,5]、金黃色葡萄球菌[5]、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌[6]和蠟樣芽孢桿菌[4-5]等，三明治中的綠葉蔬菜帶入大腸埃希氏菌O157引起食物中毒的事件也時(shí)有發(fā)生[7]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)揚(yáng)州市流通領(lǐng)域三明治類(lèi)糕點(diǎn)中的致病菌污染情況進(jìn)行了檢測(cè)，未檢出風(fēng)險(xiǎn)較高的沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和大腸埃希氏菌O157，檢出的金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌濃度較低，相關(guān)食品安全風(fēng)險(xiǎn)可控。

三明治中菌落總數(shù)的貢獻(xiàn)值大多來(lái)源于其鮮食蔬菜部分，本研究對(duì)分離自生菜的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定，假單胞菌屬（50%）和泛菌屬（45%）為其優(yōu)勢(shì)菌群。研究顯示，假單胞菌屬是生菜的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌，蔬菜自帶的好氧內(nèi)生菌應(yīng)該是造成三明治蔬菜部分快速腐敗的主要原因[8-9]。

冷加工糕點(diǎn)的人員操作、原料帶入、制作工器具、生產(chǎn)環(huán)境等均可能給產(chǎn)品帶來(lái)微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，本實(shí)驗(yàn)中蛋類(lèi)組分檢測(cè)結(jié)果的橫向?qū)Ρ缺砻?，員工操作不規(guī)范和工器具清潔不及時(shí)可能是增加產(chǎn)品污染風(fēng)險(xiǎn)的主要原因。建議生產(chǎn)者在日常管理過(guò)程中規(guī)范生產(chǎn)人員的操作步驟，及時(shí)對(duì)生產(chǎn)工器具進(jìn)行清潔消毒；監(jiān)管部門(mén)可針對(duì)以上情況對(duì)企業(yè)進(jìn)行針對(duì)性指導(dǎo)，督促企業(yè)進(jìn)一步嚴(yán)格生產(chǎn)過(guò)程管控，確保食品質(zhì)量安全。