蘋(píng)果中多菌靈的快速測(cè)定及方法評(píng)估

◎ 古麗孜巴·阿巴斯，包東東，牛貴洋，譚慧林

（阿克蘇地區(qū)食品安全檢測(cè)中心，新疆 阿克蘇 843000）

多菌靈屬于苯并咪唑類(lèi)殺菌劑，是高效、低毒和廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，被廣泛用于水果、蔬菜的病蟲(chóng)害防治[1]。此類(lèi)農(nóng)藥雖對(duì)農(nóng)作物起到了良好的保護(hù)和治療作用，但農(nóng)藥殘留過(guò)多會(huì)對(duì)食用者產(chǎn)生危害[2]。多菌靈在自然環(huán)境中降解較慢，且有一定的毒性[3]。因此，國(guó)家對(duì)多菌靈的殘留限量制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中規(guī)定，多菌靈在蘋(píng)果中的限量含量為5 mg·kg-1。目前，水果中多菌靈殘留的測(cè)定方法有液相色譜法、離子色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法等[4]。其中使用較多的方法為液相色譜法，該方法選擇性強(qiáng)、靈敏度較高，但前處理方法需要液液萃取、固相萃取等復(fù)雜的過(guò)程[5]。為縮短檢測(cè)周期，提高檢測(cè)效率，需要建立快速有效的多菌靈殘留的分析方法[1]。

本研究以《水果、蔬菜中多菌靈殘留的測(cè)定 高效液相色譜法》（GB/T 23380—2009）方法為參比方法，根據(jù)《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》，對(duì)3家公司生產(chǎn)的多菌靈快檢試劑盒的特異性、靈敏度、假陰性率、假陽(yáng)性率等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，旨在為蘋(píng)果中多菌靈的快速篩查工作提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋(píng)果樣品，均采購(gòu)于阿克蘇市銷(xiāo)售場(chǎng)所，均為阿克蘇市地產(chǎn)蘋(píng)果；硅藻土；氨水；甲醇（色譜純）；多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg·mL-1）；多菌靈快檢試劑盒（為避免評(píng)價(jià)結(jié)果作為廠家宣傳工具，簡(jiǎn)稱(chēng)為試劑盒1、試劑盒2，試劑盒3）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜配紫外檢測(cè)器；高速勻漿機(jī)（最大轉(zhuǎn)速24 000 r·min-1）；氮吹儀；旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)器。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取1 000 g以上的蘋(píng)果樣品，用干凈紗布輕輕擦去樣品表面的附著物，取可食用部分，采用對(duì)角線分割法進(jìn)行分割，取對(duì)角部分，將其切成小段，放入高速勻漿機(jī)粉碎，備用。

1.3.2 液相色譜法測(cè)定

稱(chēng)取制備樣5.00 g，加入適量硅藻土，放入加速溶劑萃取儀，使用34 mL萃取池，溫度100 ℃，壓強(qiáng)13.80 MPa，加熱5 min，以甲醇為溶劑靜態(tài)萃取5 min，60%溶劑快速?zèng)_洗試樣，60 s氣吹掃，循環(huán)1次，收集提取液，于45 ℃水浴中減壓濃縮至近干，用10 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液將殘余物溶解，移入活化后的固相萃取小柱，依次用2 mL 2%氨水、2 mL 2%氨水-甲醇溶液、2 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液和3 mL甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液，最后用3 mL 4%氨水-甲醇溶液洗脫柱子，收集洗脫液，置于45 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈桑? mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，過(guò)0.45 μm濾膜后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 快檢方法測(cè)定

（1）試劑盒1。稱(chēng)取1.0 g蘋(píng)果待測(cè)樣本，加入2 mL配套多菌靈稀釋液，混勻，充分提取5 min。取出檢測(cè)卡，用移液器吸取80 μL稀釋后的前處理待測(cè)液，垂直緩慢滴加到檢測(cè)卡加樣孔中，液體流動(dòng)時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5～6 min，根據(jù)示意圖判定結(jié)果。

（2）試劑盒2。稱(chēng)取2.0 g蘋(píng)果待測(cè)樣本，加入10 mL多菌靈稀釋液，振蕩3 min，靜置2 min。取出試紙條，水平放置，取樣品待測(cè)液70 μL垂直滴加于加樣孔中，加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)，5～8 min后即可觀察結(jié)果。

（3）試劑盒3。稱(chēng)取2.0 g蘋(píng)果待測(cè)樣本于5 mL離心管中，加入1 mL多菌靈稀釋液，充分振蕩混勻2 min。將檢測(cè)卡平放，用一次性吸管垂直滴加3滴于金標(biāo)微孔中，2 min后用滴管將微孔中的待測(cè)液混勻，將金標(biāo)微孔中的待測(cè)液全部轉(zhuǎn)移到檢測(cè)卡的加樣孔中，8～10 min后觀察結(jié)果。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》計(jì)算試劑盒的靈敏度、特異性、假陰性率、假陽(yáng)性率、顯著性差異和相對(duì)準(zhǔn)確度，使用Microsoft Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果中多菌靈農(nóng)藥殘留的測(cè)定結(jié)果

分別采用《水果、蔬菜中多菌靈殘留的測(cè)定 高效液相色譜法》（GB/T 23380—2009）方法及3種多菌靈快檢試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行多菌靈殘留的測(cè)定，結(jié)果均顯示未檢出，見(jiàn)表1。說(shuō)明在市場(chǎng)銷(xiāo)售環(huán)節(jié)的蘋(píng)果沒(méi)有多菌靈殘留。

表1 蘋(píng)果中多菌靈農(nóng)藥殘留檢測(cè)結(jié)果表

2.2 快檢試劑盒的評(píng)估

2.2.1 試劑盒1的適應(yīng)性評(píng)估

取蘋(píng)果樣品分別添加0 mg·kg-1、0.25 mg·kg-1、0.50 mg·kg-1、0.80 mg·kg-1和1.00 mg·kg-1的 多 菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.3.3步驟進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定10次。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，此試劑盒的檢出限為0.50 mg·kg-1，≥0.50 mg·kg-1即 為 陽(yáng)性樣 品，顯 色情況見(jiàn)表2。根據(jù)《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》計(jì)算，試劑盒1的靈敏度為66.67%，特異性為100%，假陰性率為33.33%，假陽(yáng)性率為0，顯著性差異為8.1，相對(duì)準(zhǔn)確率為80%，當(dāng)顯著性差異＞3.84時(shí)表示參比方法與快檢方法的陽(yáng)性確認(rèn)比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)有顯著性差異。

表2 蘋(píng)果中添加多菌靈的顯色情況表

2.2.2 試劑盒2的適應(yīng)性評(píng)估

取蘋(píng)果樣品分別添加0 mg·kg-1、0.05 mg·kg-1、0.08 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1和0.20 mg·kg-1多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.3.3步驟進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定10次。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，此試劑盒的檢出限為0.1 mg·kg-1，≥0.1 mg·kg-1即為陽(yáng)性樣品，顯色情況見(jiàn)表3。根據(jù)《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》計(jì)算，試劑盒2的靈敏度為100%，特異性66.67%，假陰性率0，假陽(yáng)性率為33.33%，顯著性差異為8.1，相對(duì)準(zhǔn)確率80%。

表3 蘋(píng)果中添加多菌靈的顯色情況表

2.2.3 試劑盒3的適應(yīng)性評(píng)估

取蘋(píng)果樣品分別添加0 mg·kg-1、0.25 mg·kg-1、0.50 mg·kg-1、0.80 mg·kg-1和1.00 mg·kg-1多 菌 靈 標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.3.3步驟進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定10次。按照說(shuō)明書(shū)，此試劑盒的檢出限為0.5 mg·kg-1，≥0.5 mg·kg-1即為陽(yáng)性樣品，顯色情況見(jiàn)表4。根據(jù)《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》計(jì)算，試劑盒3的靈敏度為100%，特異性50%，假陰性率0，假陽(yáng)性率為50%，顯著性差異為8.1，相對(duì)準(zhǔn)確率80%。其說(shuō)明書(shū)上的保存方法為避光保存，但該試劑盒外包裝是透明包裝袋，不符合該說(shuō)明書(shū)的要求。

表4 蘋(píng)果中添加多菌靈的顯色情況表

3 結(jié)論與討論

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和快檢法對(duì)阿克蘇地產(chǎn)蘋(píng)果進(jìn)行多菌靈殘留測(cè)定，結(jié)果顯示，蘋(píng)果中多菌靈殘留均為未檢出。通過(guò)在蘋(píng)果樣品中添加不同濃度的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果顯示試劑盒2、試劑盒3的靈敏度最高，均為100%，試劑盒1的特異性最高，為100%，3種快檢試劑盒的顯著性差異均大于3.84，表示在95%的置信區(qū)間有顯著性差異。根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021），多菌靈在蘋(píng)果中的限量要求是5.0 mg·kg-1，分別對(duì)3家公司生產(chǎn)的多菌靈試劑盒進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，試劑盒1的顯色濃度為0.8 mg·kg-1，試劑盒2的顯色濃度為0.08 mg·kg-1，試劑盒3的顯色濃度為0.25 mg·kg-1。說(shuō)明當(dāng)蘋(píng)果中多菌靈殘留超過(guò)5.0 mg·kg-1時(shí)，快檢方法能快速顯色，在現(xiàn)場(chǎng)可從大量樣品中篩選陽(yáng)性樣品，送到有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)，縮短了檢驗(yàn)時(shí)間。因此，此3種快檢試劑盒適合蘋(píng)果中多菌靈殘留的現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)。