除濕通痹顆粒的制備工藝研究

楊 唯，金文彬，郭媛媛，朱志坤，王 飄，陳凌云，王 濤

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500；2.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，昆明 650500

除濕通痹方由夜交藤、牛膝、王不留行、延胡索、川芎、萆薢和地龍等中藥組成，具有除濕通痹、消腫散結(jié)和行氣止痛之功效?；谇捌诖罅垦芯炕A(chǔ)，此方以中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)為原則并結(jié)合臨床應(yīng)用總結(jié)而來, 前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果表明，除濕通痹方在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gouty arthritis, AGA)的治療中有較好的療效[1]，有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。前期研究的結(jié)果表明，除濕通痹方能改善大鼠模型AGA的炎癥反應(yīng)，其可能是通過阻斷關(guān)節(jié)軟組織內(nèi)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細(xì)胞介素-1受體(interleukin-1α，IL-1α)的活性發(fā)揮作用[2]。除濕通痹方原為湯劑，為提高患者依從性以及方便攜帶，本研究參考文獻(xiàn)方法，研究該方的提取工藝[3-5]和成型工藝[6-7]，擬將其制備成顆粒劑，為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑發(fā)展提供一定的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1100Series型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；AB265-S型分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、休止角測定儀均購自寧波海曙瑞柯儀器有限公司。

1.2 試藥

2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品(即何首烏苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.0%，批號110844-201814，中國食品藥品檢定研究院)；β-環(huán)糊精(批號089517007080，山東優(yōu)索化工科技有限公司)；乙腈(色譜純，批號608001003，美國Sigma-Aldrich公司)；甲醇(色譜純，批號60300100X，美國Sigma-Aldrich公司)；水為娃哈哈純凈水；夜交藤(批號20041404)、王不留行(批號20062003)、延胡索(批號20040105)、川芎(批號20052913)、萆薢(批號20190916)、地龍(批號20052604)，均購自云南展熠藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 評價(jià)指標(biāo)

2.1.1干膏得率 取藥材共159 g，以12倍量水加熱2 h提取，重復(fù)3次，合并3次濾液濃縮成稠膏，置于烘箱中烘干，稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏得率。干膏得率=(干膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量)×100%。

2.1.2何首烏苷的轉(zhuǎn)移率 色譜條件[8]：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙腈-水(75∶25)；柱溫：35 ℃；流速：1 mL·min-1；檢測波長：320 nm；理論塔板數(shù)以何首烏苷計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

對照品溶液的制備：精密稱取何首烏苷對照品2.08 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為0.208 mg·mL-1的對照品溶液。

供試品溶液的制備：按處方稱取藥材共159 g，加12倍量水加熱提取，量取10 mL煎煮液，加入15 mL正丁醇振搖萃取，蒸干，加入10 mL稀乙醇超聲30 min，定容至10 mL，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品溶液的制備：按處方稱取除夜交藤外的其余藥材共150 g，按照供試品溶液制備方法制備，即得。

線性與范圍：精密稱取何首烏苷對照品，分別配制成質(zhì)量濃度為0.104、0.052、0.026、0.017、0.013、0.010 4 mg·mL-1的對照品溶液，高壓液相色譜法(high-pressure liquid chromatography，HPLC)測定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、以峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：y=18 530x-158.66(r2=0.999 6)，結(jié)果表明何首烏苷在質(zhì)量濃度為0.010 4～0.104 0 mg·mL-1的范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

專屬性實(shí)驗(yàn)：通過比較陰性樣品溶液和對照品溶液的色譜圖，判斷所用的色譜條件是否有內(nèi)源性物質(zhì)干擾何首烏苷出峰，專屬性考察結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，何首烏苷在所用色譜條件下的專屬性良好。

注：A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.何首烏苷。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取1份同一批樣品的供試品溶液，用HPLC法分別在0、2、4、6、8、10、12 h測定峰面積，測得峰面積分別為231.4、228.5、224.1、225.7、221.4、221.2、227.9，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取6份同一批樣品制成供試品溶液，用HPLC法測定峰面積，分別測得峰面積為231.40、232.80、228.50、228.00、224.10、226.00，結(jié)果顯示該方法的重復(fù)性良好。

加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密量取6份同一批已知夜交藤含量的提取液5 mL，依次加入已知質(zhì)量濃度的何首烏苷對照品溶液1.5、1.5、1.8、1.8、2.2、2.2 mL中，制備成加樣供試品溶液，HPLC法測定峰面積，分別考察何首烏苷的含量和回收率。何首烏苷的平均回收率為98.69%，RSD值為2.53%，表明該方法測得的結(jié)果準(zhǔn)確可信。

樣品含量測定：精密稱定干膏2.0 g，制成供試品溶液，用HPLC法分析，測定峰面積，得出何首烏苷的含量。

夜交藤含量測定：精密稱取夜交藤粉末0.502 0 g，量取25 mL乙醇加入夜交藤粉末中，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，冷卻至室溫，補(bǔ)足乙醇損失量，搖勻，過濾，即得藥材樣品溶液，用HPLC法分析，得出何首烏苷的含量。

轉(zhuǎn)移率計(jì)算：轉(zhuǎn)移率=(樣品中何首烏苷的含量/夜交藤中何首烏苷的含量)×100%。

2.2 提取工藝優(yōu)化

選擇加水倍數(shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素，以干膏得率和何首烏苷轉(zhuǎn)移率的綜合評分為指標(biāo)進(jìn)行考察[9]，權(quán)重系數(shù)分別為0.3、0.7，綜合評分=[(何首烏苷含量/何首烏苷最大含量×0.7)+(干浸膏得率/干浸膏得率最大值×0.3)]×100%。按處方稱取藥材9份，每份159 g，按L9(34)正交表(表1)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，依照上述方法制成供試品溶液，用HPLC法分析。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，分別考察各因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，最終各參數(shù)的水平由考察結(jié)果確定，據(jù)此篩選出最佳提取工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)安排和結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

由表2可見，以何首烏苷轉(zhuǎn)移率為評價(jià)指標(biāo)，加水量(A)、提取次數(shù)(B)、提取時(shí)間(C)3個(gè)影響因素極差大小順序?yàn)椋篊>B>A，最佳提取工藝為A3B3C3。方差分析結(jié)果顯示，提取時(shí)間對何首烏苷轉(zhuǎn)移率的影響顯著，加水倍數(shù)和提取次數(shù)對何首烏苷轉(zhuǎn)移率的影響不顯著。綜合考慮直觀分析與方差分析結(jié)果，最終確定除濕通痹顆粒提取工藝為：加水倍數(shù)12 倍，提取3 次，提取2 h。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取6份處方藥材，每份159 g，按照上述篩選出的最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以干膏得率和何首烏苷含量為評價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，除濕通痹顆粒的提取工藝穩(wěn)定、重復(fù)性較好。

表2 正交實(shí)驗(yàn)安排和結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

表4 提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 除濕通痹顆粒的成型工藝

2.4.1除濕通痹顆粒稠膏的制備 稱取藥材，以12倍量水加熱提取2 h，重復(fù)3次，合并3次濾液，將濾液濃縮成稠膏，備用。

2.4.2評價(jià)指標(biāo) 將軟材的選定和顆粒一次性收率等作為評價(jià)指標(biāo)，綜合上述指標(biāo)對成型工藝進(jìn)行分析。

顆粒成型率的測定：精密稱定制備好的干顆粒質(zhì)量，過篩，稱定過1號篩但不過5號篩顆粒的質(zhì)量。顆粒成型率=(過篩后顆粒質(zhì)量/過篩前顆粒質(zhì)量)×100%。

顆粒休止角的測定：取交錯(cuò)串聯(lián)固定的3只漏斗，調(diào)整最下面漏斗的下口與水平鋪放在桌面上坐標(biāo)紙的距離為3 cm，緩慢沿壁將顆粒倒入最上面的漏斗中，直至坐標(biāo)紙上形成的顆粒圓錐體的尖端剛好接觸到漏斗下口，通過坐標(biāo)紙測量圓錐底部直徑(2r)，計(jì)算顆粒休止角。tan α=h/r。

顆粒溶化性的測定：依據(jù)《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020 年版四部顆粒劑制劑通則(0104)中對可溶顆粒溶化性檢查的規(guī)定，稱取供試品10 g，加入200 mL水，攪拌 5 min后及時(shí)觀察，若顆粒全部溶化或輕微渾濁則為合格。

何首烏苷轉(zhuǎn)移率：精密稱取何首烏苷對照品2.08 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為0.208 mg·mL-1的對照品溶液。取干膏粉末2.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇100 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇補(bǔ)足損失量，取上清液過濾，即得供試品溶液。按比例稱取除夜交藤以外的處方藥材，按照供試品溶液的制備方法制成缺夜交藤的陰性對照溶液。

2.5 輔料考察

2.5.1賦形劑種類考察 運(yùn)用單一輔料考察方法[10]，稱取1倍處方量，濃縮成稠膏，分為5份，分別將各單一輔料按稠膏量的75%加入，5份均同法操作，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，賦形劑選用β-環(huán)糊精的顆粒一次收率最高，為85.37%。

2.5.2賦形劑用量考察 按比例稱取處方藥材，制得4份稠膏，分別加入稠膏量1.5、2、2.5、3倍的β-環(huán)糊精。記錄軟材情況、制粒情況、顆粒情況，結(jié)果見表6。

表5 單種輔料考察結(jié)果

表6 賦形劑用量考察結(jié)果

2.6 烘干條件考察

取3份同法制得的濕顆粒，評價(jià)指標(biāo)選定為干燥時(shí)間、成品率及顆粒外觀質(zhì)量，分別考察上述評價(jià)指標(biāo)對顆粒制備的影響程度，據(jù)此篩選出最佳干燥條件[成品率=(過1號篩但不過5號篩的顆粒質(zhì)量/總顆粒質(zhì)量)×100%]。烘干條件考察結(jié)果見表7。由表7可知，干燥溫度為70 ℃時(shí)，顆粒成型率較高且顆粒外觀質(zhì)量較好，質(zhì)地疏松。最佳干燥條件為70 ℃，干燥8 h。

表7 烘干條件考察結(jié)果

2.7 成型工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按比例稱取3份處方藥材，制備成稠膏，依次加入3倍稠膏量的β-環(huán)糊精，過1號篩制粒，干燥溫度70 ℃，干燥時(shí)長8 h，整粒，即得。顆粒成型工藝驗(yàn)證結(jié)果見表8。

由表8可知，顆粒的成型率分別為84.1%、83.8%、86.9%，何首烏苷轉(zhuǎn)移率分別為63.20%、66.90%、52.76%。依據(jù)《中國藥典》2020年版四部顆粒劑通則(0104)，顆粒的溶化性、粒度均符合規(guī)定且顆?？诟?、流動性等考察結(jié)果基本一致。據(jù)此可得出除濕通痹顆粒的最佳成型工藝：按稠膏∶賦形劑=1∶3的比例加入β-環(huán)糊精，過1號篩制粒，干燥溫度70 ℃，干燥時(shí)長8 h，過1號篩和5號篩整粒，即得。

3 討論

除濕通痹方的君藥為王不留行、萆薢，共奏活血通經(jīng)、利濕去濁、祛風(fēng)除痹之效；臣以茯苓、澤瀉利水滲濕、祛痰、泄熱，延胡索、川芎、丹參活血行氣、祛瘀止痛，地龍、伸筋草、夜交藤祛風(fēng)通絡(luò)，荊芥、防風(fēng)、前胡、桔梗疏風(fēng)散熱，解表去痰；焦山楂消肉食積滯、行氣散瘀，神曲消食和胃，甘草調(diào)和諸藥并可補(bǔ)脾益氣、緩急止痛、清熱祛痰，三藥合用以為佐使；諸藥合用，共同達(dá)到治療風(fēng)濕痹痛的目的。研究結(jié)果顯示，牛膝總皂苷可緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性期的癥狀，其通過抑制嗜中性白細(xì)胞堿性磷酸酶3(neutrophilic alkaline phosphatase-3，NALP3)及caspase-1的活化發(fā)揮作用，從而降低炎性因子的活化水平，可在一定程度上治療大鼠AGA[11]。

表8 成型工藝驗(yàn)證結(jié)果

萆薢的主要成分萆薢總皂苷通過降低血清IL-18、TNF-α和IL-1β等炎性因子的水平，從而抑制NALP3炎性體的裝配與活化，起到防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用[12]。該方中夜交藤、王不留行和桔梗等的有效成分主要為苷類[13-14]，延胡索和川芎等的有效成分為生物堿[15-16]，地龍的有效成分主要為氨基酸[17]，茯苓的有效成分主要為多糖[18]，以上有效成分的水溶性均較好，因此采用水提法。依照《中國藥典》2020版一部的規(guī)定，本方中的夜交藤應(yīng)檢測何首烏苷(C20H22O9)的含量，故將何首烏苷轉(zhuǎn)移率作為考察提取工藝的評價(jià)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HPLC法對何首烏苷進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，何首烏苷的分離度高，峰形較好，無其他雜質(zhì)峰干擾，專屬性強(qiáng)，該條件下測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、精密度、重復(fù)性均較好，可作為何首烏苷的測定方法。

正交實(shí)驗(yàn)具有科學(xué)性高、步驟簡單、節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，在中藥提取工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)中被廣泛應(yīng)用[19]。本研究將加水倍數(shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)作為考察因素，以干膏得率和何首烏苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，對除濕通痹顆粒的提取工藝進(jìn)行考察。結(jié)果表明，提取時(shí)間對綜合評分的影響最大，其次是提取次數(shù)和加水倍數(shù)，綜合干膏得率和何首烏苷轉(zhuǎn)移率等評價(jià)指標(biāo)，得出其最佳提取工藝為：提取3次，每次加12倍量水，提取時(shí)間2 h。

顆粒成型工藝中，欲將其制為無糖型顆粒，使糖尿病患者也可服用，因此選用β-環(huán)糊精為賦形劑。稠膏是本方的成型工藝原料，由于量較大，用干法制粒和稠膏制粒的實(shí)際可行性小，因此本研究采用在稠膏中加入輔料的方法制粒[20]。此外，軟材的選定和顆粒一次性收率等為考察輔料情況的評價(jià)指標(biāo)。得出其最佳成型工藝為：稠膏∶β-環(huán)糊精=1∶3，過1號篩制粒，干燥溫度為70 ℃，干燥時(shí)間為8 h，過1號篩和5號篩整粒，即得。