黃連素對CYP3A的體內(nèi)外作用及相關(guān)性研究

唐 霞，張 茂，歐陽萌

1.四川省宜賓市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，宜賓 644000；2.中國人民解放軍武漢總醫(yī)院臨床藥理科，武漢 430070

CYP3A是細(xì)胞色素P450(CYP)超家族中一個重要的藥物氧化代謝酶，主要存在于肝臟和小腸，是體內(nèi)含量最豐富的代謝酶。CYP3A參與多種內(nèi)、外源性化合物和超過50%的臨床常用藥物的代謝[1]。CYP3A代謝大部分的臨床常用藥物，其活性高低影響許多藥物的療效以及對患者的毒性和不良反應(yīng)，而CYP3A本身又可被多種藥物誘導(dǎo)或抑制，藥物誘導(dǎo)或抑制CYP3A后通常使其底物代謝加速或減慢，導(dǎo)致藥物間存在相互作用的潛在可能[1]。前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，黃連素(BBR)在體外對大鼠和小鼠肝臟、小腸的細(xì)胞色素P450酶CYP3A1、CYP3A2有抑制作用[2-3]。在此基礎(chǔ)上，本實驗進(jìn)一步闡明BBR在人肝癌HepG2細(xì)胞中對CYP3A4分子表達(dá)的影響和在大鼠體內(nèi)對CYP3A酶活性的影響，初步探討其作用機(jī)制和體、內(nèi)外作用是否存在相關(guān)性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司)；MyCyclerTMPCR儀(美國Bio-Rad公司)；ABI PRISM?7900HT Sequence Detection System(美國Applied Biosystems公司)；高速冷凍離心機(jī)(中國安徽中科中佳科學(xué)儀器公司)。Agilent 1100型高效液相色譜儀(包括G1311A型四元泵、G1313A型自動進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G1314A型紫外檢測器和Agilent化學(xué)工作站，美國Agient公司)； TTL-DCⅡ型氮吹儀(北京同奉聯(lián)科技發(fā)展有限公司)；BT255型電子分析天平(德國賽多利斯公司)； WH-1 微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(SDS-PAGE，北京天一儀器廠)；Delta320 型pH計(上海梅特勒-托利多有限公司)。

1.2 試藥

胎牛血清(杭州四季青公司)；改良型RPMI-1640(美國Thermo公司)；利福平(Rifampicin，中國BioSHARP公司)；Trizol和RIPA細(xì)胞裂解液，均購自中國碧云天公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(美國Amresco公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；SYBR?Select Masrer Mix(美國Applied Biosystems公司)；qRT-PCR引物(鼎國生物公司合成)；抗Cytochrome P4503A4抗體(美國Abcam公司)；抗小鼠β-actin單克隆抗體、羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP和羊抗兔IgG(H+L)-HRP，均購自天津三箭生物技術(shù)公司；咪達(dá)唑侖(MDZ)對照品(上?，F(xiàn)代制藥有限公司贈送，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)；1′-羥基咪達(dá)唑侖(1′-OH-MDZ)對照品(德國Dr.Margarete Fischer-Bosch臨床藥理研究所Ulrich Klotz教授贈送)；地西泮(DZP)對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號230-9601)；酮康唑(TKZ)原料藥(北京嘉德鴻盛生物化學(xué)科技有限公司，批號cc-4309)；鹽酸黃連素(上海天平制藥廠，相對分子質(zhì)量為407.85,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，批號990801)；正己烷和二氯甲烷為色譜純，均購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；甲醇和乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸和三乙胺均為市售分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ECL發(fā)光液(南京生航生物技術(shù)有限公司)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，上?；茖嶒炂鞑挠邢薰?；TBST緩沖液(上海威奧生物科技公司)；蒸餾水經(jīng)重蒸餾處理。

1.3 細(xì)胞和動物

HepG2細(xì)胞購自上海細(xì)胞生物研究所；SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量為(250±20) g，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2008-004。

2 方法

2.1 體外細(xì)胞實驗

采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法在BBR對HepG2細(xì)胞毒性較小的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)進(jìn)行實驗，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液配成質(zhì)量濃度為 800 μg·mL-1的BBR母液和濃度為1 000 μmol·L-1的利福平(Rif)母液；并用一次性滅菌濾器(0.22 μm)過濾除菌，使用前超聲混勻[4]。人肝癌細(xì)胞HepG2在含有10 mg·mL-1胎牛血清的改良型RPMI-1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，實驗時按細(xì)胞5×105個·L-1接種至6孔培養(yǎng)板，用含2 mg·mL-1胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后給藥，給藥時采用連續(xù)倍比稀釋使BBR質(zhì)量濃度分別為40.0、10.0、2.0、0.5、0.1、0 μg·mL-1以及40 μg·mL-1BBR+10 μmol·L-1Rif，10 μg·mL-1BBR+10 μmol·L-1Rif，2 μg·mL-1BBR+10 μmol·L-1Rif，0.5 μg·mL-1BBR+10 μmol·L-1Rif，0.1 μg·mL-1BBR+10 μmol·L-1Rif和10 μmol·L-1Rif，每孔加入含藥培養(yǎng)液8 mL，在37 ℃體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h[4]。利用Trizol抽提細(xì)胞總RNA，取總RNA 2 μg,用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，(逆轉(zhuǎn)錄條件：95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s)40個循環(huán)，每組設(shè)3個復(fù)孔?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量=2-△△CT，即2-[(CTTarget gene實驗組-CTβ-actin實驗組)-(CTTarget gene對照組-CTβ-actin對照組)]，用于進(jìn)行qRT-PCR的引物，見表1。

收集6孔板細(xì)胞，加入100 μL預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液，置于冰上搖床20 min，用刮子刮下細(xì)胞吸至離心管中，在4 ℃以12 000 r·min-1離心5 min，取上清并用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。取30 μg蛋白加入上樣緩沖液，經(jīng)100 ℃、5 min變性后用SDS-PAGE分離。蛋白半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5 g·L-1脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，分別孵育兔抗人CYP3A4的一抗、小鼠抗人P-糖蛋白(P-gp)的一抗、小鼠抗人β-actin的一抗，4 ℃搖床過夜，TBST洗滌3次，分別用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗滌3次，加入ECL發(fā)光液反應(yīng)5 min后用Bio-rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行自動曝光，并用Quantity One軟件測定各顯色條帶的光密度值進(jìn)行分析[4]。以各組目的蛋白與β-actin灰度值的比值作為各組蛋白表達(dá)的相對含量。

2.2 大鼠體內(nèi)藥動學(xué)實驗

將40只SD雄性大鼠隨機(jī)分成5組，每組8只。分別為空白對照(生理鹽水)組、BBR低劑量給藥組(50 mg·kg-1)、BBR中劑量給藥組(100 mg·kg-1)、BBR高劑量給藥組(200 mg·kg-1)和陽性對照酮康唑(75 mg·kg-1)組。每只大鼠按照0.01 mL·g-1給藥，每日1次，連續(xù)灌胃10 d后，第10天晚上開始禁食12 h，于實驗前給予第11次灌胃[5]。大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥進(jìn)行麻醉固定，分離股動脈，插套管針，于灌胃30 min后通過十二指腸給予2 mg·mL-1的MDZ(20 mg·kg-1)后，分別于0、2、5、10、20、30、60、90、120、180 min通過靜脈留置針采腹股溝動脈血0.6 mL，置于1 mL肝素化抗凝EP管中，分離血漿，于-40 ℃冷藏。采血30 min后經(jīng)十二指腸補(bǔ)充3 mL糖鹽水(100 g·L-1葡萄糖液∶生理鹽水=3∶7)[5]。精確吸取各時間點(diǎn)采集的血漿樣品250 μL，加入內(nèi)標(biāo)(400 ng·mL-1DZP)20 μL，碳酸鹽緩沖液(1 mol·L-1，pH 10.0)200 μL，渦旋振蕩30 s，再加入5 mL萃取液(正己烷∶二氯甲烷=7∶3)，渦旋振蕩5 min，以3 000 r·min-1離心10 min，取出上層有機(jī)相4.5 mL，于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈桑?50 μL流動相溶解殘留物，取50 μL進(jìn)行HPLC分析。

色譜條件：色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液(0.02 mol·mL-1，0.1 mg·mL-1三乙胺，pH 3.7)(20∶42∶38)；紫外檢測波長：230 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：40 ℃[6-7]。

表1 熒光定量PCR引物

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 BBR對HepG2細(xì)胞CYP3A4基因影響的qRT-PCR分析

qRT-PCR分析結(jié)果表明，BBR對CYP3A4 mRNA顯示抑制作用，與空白對照組比較，10 μg·mL-1BBR抑制了CYP3A4 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，隨著BBR質(zhì)量濃度的增大，在高質(zhì)量濃度(20、40 μg·mL-1)時對CYP3A4 mRNA表達(dá)的抑制作用則更強(qiáng) (P<0.01)；同時與空白對照組比較，Rif誘導(dǎo)了CYP3A4 mRNA的表達(dá)(P<0.01)；與Rif組比較，10 μg·mL-1BBR+10 μmol·L-1Rif，20 μg·mL-1BBR+10 μmol·L-1Rif和40 μg·mL-1BBR+10 μmol·L-1Rif組中BBR顯著抑制了Rif對CYP3A4的誘導(dǎo)作用(P<0.01)，隨著BBR質(zhì)量濃度的增加，抑制作用越強(qiáng)，見表2。

表2 實時熒光定量法分析HepG2細(xì)胞中CYP3A4 mRNA表達(dá)的影響

3.2 BBR對HepG2細(xì)胞CYP3A4影響的Western-Blot分析

Western Blot分析結(jié)果顯示，與空白對照組比較，0.1、0.5、2.0 μg·mL-1BBR組可使CYP3A4蛋白表達(dá)增加(P<0.05),且呈劑量依賴性；10、40 μg·mL-1BBR使CYP3A4蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見圖1和表3。

注：1.空白對照組；2.0.1 μg·mL-1BBR;3.0.5 μg·mL-1BBR;4.2 μg·mL-1BBR;5.10 μg·mL-1BBR;6.40 μg·mL-1BBR;7.10 μmol·L-1Rif；8.0.1 μg·mL-1BBR+10 μmol·L-1Rif；9.0.5 μg·mL-1BBR+10 μmol·L-1 Rif；10.2 μg·mL-1BBR+10 μmol·L-1Rif；11.10 μg·mL-1 BBR+10 μmol·L-1Rif；12.40 μg·mL-1 BBR+10 μmol·L-1Rif

3.3 BBR對大鼠MDZ和1′-OH-MDZ血藥質(zhì)量濃度的影響

3.3.1BBR對大鼠MDZ血藥質(zhì)量濃度的影響 服用不同藥物后，在大鼠血漿MDZ質(zhì)量濃度-時間變化曲線中，BBR 50、100、200 mg·kg-1組介于空白對照組和陽性對照酮康唑組之間，由此可知，BBR可以升高大鼠血漿MDZ的質(zhì)量濃度，隨著BBR質(zhì)量濃度的升高，作用效應(yīng)有所增加，但BBR 100、200 mg·kg-1組區(qū)別不明顯，僅陽性對照酮康唑組大鼠血漿MDZ的質(zhì)量濃度顯著高于空白對照組(P<0.01)；BBR 200 mg·kg-1組大鼠血漿MDZ的質(zhì)量濃度顯著高于空白對照組(P<0.05)。見圖2。

3.3.2BBR對大鼠1′-OH-MDZ血藥質(zhì)量濃度的影響 服用不同藥物后，在大鼠血漿1′-OH-MDZ質(zhì)量濃度-時間變化曲線中，與空白對照組比較，陽性對照酮康唑組能顯著降低大鼠血漿1′-OH-MDZ的質(zhì)量濃度(P<0.01)；BBR 200 mg·kg-1組大鼠血漿1′-OH-MDZ的質(zhì)量濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)。見圖3。

表3 BBR對HepG2細(xì)胞CYP3A4蛋白表達(dá)的影響

3.4 BBR對大鼠MDZ和1′-OH-MDZ藥代動力學(xué)參數(shù)的影響

結(jié)果顯示，BBR能夠顯著升高M(jìn)DZ的藥時曲線下面積(AUC(0～t))、藥時矩曲線下面積AUMC(0～t)和血藥達(dá)峰質(zhì)量濃度Cmax(P<0.05)，并且能夠減慢其清除率(CLz)和減小MDZ在體內(nèi)的表觀分布容積(Vz)(P<0.05)，但是對MDZ的半衰期(t1/2)和血藥質(zhì)量濃度達(dá)峰時間(tmax)無顯著影響。同時，BBR能顯著降低1′-OH-MDZ的AUC(0～t)、AUMC(0～t)和Cmax(P<0.05)，能夠加快1′-OH-MDZ在體內(nèi)的代謝，即CLz，并增大其Vz(P<0.05)，對t1/2無顯著影響。見表4和表5。

表5 大鼠給予BBR或酮康唑后1′-羥基咪達(dá)唑侖的平均藥動學(xué)參數(shù)

4 討論

前期臨床研究證明了BBR對增加腎移植患者環(huán)孢素A(CsA)血藥質(zhì)量濃度的有效性、安全性以及藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)價值；腎移植接受者和健康受試者的人體藥動學(xué)研究證明了BBR與CsA合用對CsA有增效作用[8-9]，此外，BBR在體外對大鼠和小鼠肝臟、小腸的細(xì)胞色素P450酶和P-gp有抑制作用；本課題組在前期一系列研究的基礎(chǔ)上，從大鼠體內(nèi)水平尋找BBR對CYP3A活性影響的直接證據(jù)，再從人體細(xì)胞水平研究BBR對CYP3A4的影響，并初步探索其作用機(jī)制及體內(nèi)外作用效應(yīng)是否存在相關(guān)性。

在人肝臟中CYP3A亞族最主要的亞型是CYP3A4,而在大鼠肝臟中CYP3A亞族最主要的亞型為CYP3A1和CYP3A2。以往的動物水平研究已證實：BBR對大鼠和小鼠肝臟、小腸的CYP3A有抑制作用，BBR是CYP3A的抑制劑[2-3,10-11]。通過大鼠體內(nèi)實驗，進(jìn)一步證實了BBR在動物體內(nèi)對CYP3A活性的影響；體外實驗又通過以人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞為對象研究BBR對人CYP3A4m RNA水平和蛋白表達(dá)的影響。大鼠體內(nèi)實驗結(jié)果表明， BBR可顯著抑制MDZ的代謝，該抑制作用可能是BBR抑制了MDZ的代謝酶CYP3A的活性所致。體外實驗表明，較低質(zhì)量濃度的BBR對CYP3A4蛋白表達(dá)有明顯的誘導(dǎo)作用，較高質(zhì)量濃度的BBR對CYP3A4蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用，但BBR對人CYP3A4 mRNA水平只有較高質(zhì)量濃度時的抑制作用，與蛋白表達(dá)趨勢也不完全一致。由此可知，BBR對CYP3A4的抑制效應(yīng)在體內(nèi)外表現(xiàn)較為一致，但誘導(dǎo)效應(yīng)僅僅表現(xiàn)在體外低劑量時對蛋白表達(dá)的影響，因此還需要進(jìn)一步的驗證。

MDZ為鎮(zhèn)靜催眠藥，近年來越來越多的研究選用MDZ作為CYP3A的代謝“探針”[12]。MDZ完全通過CYP3A代謝，是一個適用于體內(nèi)、外均理想的CYP3A探針。MDZ在人體內(nèi)主要通過CYP3A4酶代謝，在大鼠、小鼠體內(nèi)主要經(jīng)CYP3A1/2酶代謝，主要代謝產(chǎn)物為1′-OH-MDZ[12]。因此檢測藥物對MDZ和1′-OH-MDZ的代謝變化的影響，可間接用來評價藥物對CYP3A酶的影響。另外，酮康唑為已知的CYP3A抑制劑，被廣泛用于CYP3A的活性研究[13]，因此本實驗選擇酮康唑研究其對CYP3A活性的抑制。Rif作為CYP3A4和MDR1等基因的有效激動劑，在國內(nèi)外已得到普遍公認(rèn)[14-17]，本實驗中在以Rif作為誘導(dǎo)劑的基礎(chǔ)上研究BBR對CYP3A4 mRNA水平和蛋白表達(dá)的影響。

由CYP3A和P-gp介導(dǎo)的藥物相互作用已成為近年來的研究熱點(diǎn)，臨床治療中需盡量避免藥物的相互作用，但有時也可以通過藥物的相互作用來達(dá)到某些需要的治療效果[18]。例如在腎移植患者中常利用BBR來提高CsA的血藥質(zhì)量濃度。CsA是器官移植患者尤其是腎移植患者應(yīng)用最多的一種免疫抑制劑，由于價格昂貴，近年來陸續(xù)研究了一些環(huán)孢素的增效劑，尋找高效低毒的CsA增效劑成為目前臨床上器官移植領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題之一[19-20]。在人體內(nèi)，CsA主要由肝臟和小腸CYP3A4代謝生成羥化物或N-去甲基衍生物，因此，CsA通過肝或小腸CYP酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp的誘導(dǎo)或抑制與其他藥物發(fā)生相互作用，成為尋找CsA增效劑的主要途徑。多年的器官移植臨床藥學(xué)實踐發(fā)現(xiàn)，BBR對CsA具有增效作用，以CYP3A和P-gp介導(dǎo)的藥物相互作用為出發(fā)點(diǎn)，對其作用和作用機(jī)制進(jìn)行研究，使本課題更具有臨床實用價值。