水通道蛋白9在PCOS大鼠卵巢組織的表達(dá)*

潘海霞，冼佩宜，張春仁，林 菡，何曉瑩，唐慧珍，賴毛華△

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合臨床婦科，廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中醫(yī)婦科，廣州 510120)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種常見(jiàn)的婦科內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，據(jù)報(bào)道，育齡婦女中PCOS的患病率為6%～10%[1]，具有高度異質(zhì)性、發(fā)病多因性、表現(xiàn)多態(tài)性的特點(diǎn)。臨床主要表現(xiàn)為閉經(jīng)、多毛、肥胖、高胰島素血癥、高雄激素血癥、不孕，超聲顯示多囊卵巢等[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，75%的PCOS患者表現(xiàn)為無(wú)排卵性不孕[2]，卵泡發(fā)育障礙是導(dǎo)致PCOS不孕的主要原因。因此，探究PCOS卵泡發(fā)育障礙的機(jī)制對(duì)提高PCOS患者的生育力具有重要意義。

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組存在于細(xì)胞膜上的小分子蛋白家族，可使細(xì)胞膜對(duì)水的通透性增加，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)外的水平衡意義重大。目前在哺乳動(dòng)物中鑒定出13種AQPs(AQP0～12)亞型。AQP0、1、2、4、5、6和8對(duì)水的通過(guò)具有高度的選擇性，而AQP3、7、9和10不僅運(yùn)輸水，還運(yùn)輸中性溶質(zhì)，包括甘油、尿素和其他小的非電解質(zhì)[3]。WAWRZKIEWICZ等[4]認(rèn)為AQPs可能參與了PCOS的發(fā)生，其表達(dá)的變化可能影響PCOS的卵泡發(fā)育和卵泡閉鎖。QU等[5]發(fā)現(xiàn)PCOS患者顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中存在 AQP9，PCOS組的AQP9表達(dá)水平明顯低于正常組，AQP9與卵泡液的雄激素水平有明顯的相關(guān)性。SONG等[6]發(fā)現(xiàn)PCOS患者顆粒細(xì)胞AQP9基因和蛋白表達(dá)水平較低，AQP9的表達(dá)水平與胰島素調(diào)節(jié)呈負(fù)相關(guān)，胰島素可能通過(guò)改變AQP9的表達(dá)影響PCOS卵泡的成熟。因此，推測(cè)AQP9可能參與了PCOS的卵泡發(fā)育障礙的發(fā)生，但確切的機(jī)制尚不清楚。

本研究主要通過(guò)來(lái)曲唑灌胃建立PCOS大鼠模型，采用免疫組織化學(xué)和Western blot觀察AQP9在卵巢組織中的定位及蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步探討AQP9與PCOS卵泡發(fā)育的關(guān)系提供理想的動(dòng)物模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雌性大鼠12只，6周齡，超級(jí)清潔(SPF)級(jí)，體重(155±10)g，購(gòu)自廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。自由攝取食物和水，溫度20～22 ℃，濕度60%～65%，控制12 h光照、12 h黑暗環(huán)境循環(huán)，喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料。本研究獲得廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1PCOS模型的建立

12只SD雌性大鼠，分為正常組與模型組，每組6只。模型組參考文獻(xiàn)[7]的造模方法，每天予來(lái)曲唑(1 mg/kg)溶于0.5%羧甲基纖維素(CMC，2 mL/kg)灌胃，構(gòu)建PCOS模型；正常組每天灌胃0.5% CMC(2 mL/kg)，連續(xù)21 d。

1.2.2標(biāo)本處理

最后1次灌胃后，稱重，兩組大鼠晚8時(shí)開(kāi)始禁食，次日晨8時(shí)尾靜脈采血，用葡萄糖氧化酶法測(cè)空腹血糖(羅氏血糖儀)，然后異氟烷氣體麻醉后進(jìn)行心臟采血，3 000 r/min離心15 min，-80 ℃凍存用于進(jìn)一步測(cè)試，最后斷頸處死大鼠，摘取雙側(cè)卵巢，去除表面脂肪組織觀察兩組大鼠卵巢大體解剖情況，稱重并記錄后，一側(cè)浸泡在4%的多聚甲醛中進(jìn)行固定以便后續(xù)的組織病理分析，一側(cè)卵巢放在凍存管中，以便后續(xù)的蛋白和基因的檢測(cè)分析。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1大鼠體重、陰道涂片及卵巢質(zhì)量

每天灌胃之前對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，且記錄數(shù)據(jù)。灌胃第10天開(kāi)始對(duì)模型組大鼠進(jìn)行陰道涂片，陰道涂片兩個(gè)動(dòng)情周期(10 d)，使用瑞氏-吉薩姆進(jìn)行染色，通過(guò)分析白細(xì)胞、上皮細(xì)胞和角化細(xì)胞的相對(duì)比例來(lái)監(jiān)測(cè)動(dòng)情周期。吸入麻醉處死大鼠后，稱重雙側(cè)卵巢，左、右卵巢的質(zhì)量計(jì)算卵巢質(zhì)量。

1.2.3.2性激素及糖代謝檢測(cè)

使用ELISA法進(jìn)行血清中黃體生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)、雄激素、雌二醇和空腹胰島素測(cè)定，羅氏血糖儀測(cè)空腹血糖。計(jì)算LH/FSH和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，HOMA-IR=(空腹胰島素×空腹血糖)×22.5。

1.2.3.3卵巢組織學(xué)改變

在解剖鏡下剝除卵巢外周脂肪，觀察卵巢大體解剖情況。卵巢用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片及蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)

按照試劑說(shuō)明書，石蠟包埋，蠟塊做5 μm的切片，將玻片置于60 ℃恒溫箱烤30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。3%過(guò)氧化氫溶液10 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。微波修復(fù)抗原。滴加5%牛血清，38 ℃下孵育10 min，傾去勿洗。滴加一抗兔抗大鼠AQP9(美國(guó)Santa Cruz公司)，4 ℃過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，3次。滴加對(duì)應(yīng)生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃下孵育30 min，PBS沖洗。滴加SABC，37 ℃下孵育20 min，PBS沖洗。DAB顯色：除去PBS，每張切片加新鮮配制的DAB溶液顯色，自來(lái)水沖洗。梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.3.5Western blot

按照試劑說(shuō)明書，將100 mg的卵巢組織放入0.6 mL裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1,v/v)中裂解，用冰凍露卡勻漿機(jī)強(qiáng)力粉碎。勻漿于4 ℃、1 200 r/min離心20 min。轉(zhuǎn)移并收集上清液用于蛋白分析。每個(gè)樣品的蛋白濃度采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定。隨后，將提取的樣品煮沸10 min，-80 ℃保存待分析。負(fù)載蛋白(50 g)電泳，在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(0.22 m,美國(guó)Pall公司)。PVDF膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，然后用不同的一抗孵育4夜，包括抗AQP9 (美國(guó)Santa Cruz公司)和抗β-actin(美國(guó)Abcam公司)。一抗一般用TBST (Tris-HCl 5 mmol/L,pH 7.6,NaCl 136 mmol/L,0.05% Tween-20) 1∶1 000稀釋。洗后TBST 3次，再與辣根過(guò)氧化物(HRP)結(jié)合二抗(1∶5 000稀釋TBST)孵育2 h，與一抗結(jié)合。Western blot采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)。圖像采用Bio-Rad進(jìn)行采集，Image-J軟件進(jìn)行密度測(cè)定分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組體重、卵巢質(zhì)量和陰道涂片比較

與正常組比較，模型組體重和卵巢質(zhì)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、2。正常組具有規(guī)律的動(dòng)情周期，模型組則幾乎處于以白細(xì)胞為主的動(dòng)情間期，見(jiàn)圖3。

a：P<0.05。

a：P<0.05。

A：正常組動(dòng)情期；B：正常組動(dòng)情前期；C：正常組動(dòng)情間期；D：正常組動(dòng)情后期；E：模型組動(dòng)情間期。

2.2 兩組血清性激素及糖代謝指標(biāo)比較

與正常組比較，模型組LH、LH/FSH、雄激素、空腹胰島素和HOMA-IR水平升高，F(xiàn)SH和雌二醇水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組血清性激素及糖代謝指標(biāo)比較

2.3 卵巢組織學(xué)改變

正常組卵巢色澤紅，表面光滑，卵巢結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)不同發(fā)育階段的卵泡，多個(gè)黃體，顆粒細(xì)胞呈多層，形態(tài)完整，排列整齊。模型組卵巢形態(tài)蒼白，可見(jiàn)較多的早期發(fā)育小卵泡及閉鎖卵泡，有較多擴(kuò)張的囊泡，卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞消失，卵巢顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，卵泡膜細(xì)胞增生，黃體數(shù)量明顯下降，見(jiàn)圖4。

A：正常組，×20；B：正常組，×200；C：模型組，×20；D：模型組，×200。

2.4 兩組卵巢AQP9蛋白免疫組織化學(xué)染色情況

兩組卵巢顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、黃體細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞均可見(jiàn)AQP9蛋白表達(dá)，但以顆粒細(xì)胞較明顯，主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色，模型組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞 AQP9蛋白的表達(dá)較正常組降低，見(jiàn)圖5。

A：正常組，×50；B：正常組，×400；C：模型組，×50；D：模型組，×400。

2.5 兩組卵巢 AQP9 蛋白表達(dá)情況

模型組AQP9蛋白表達(dá)水平較正常組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

a：P<0.05。

3 討 論

來(lái)曲唑是一種高選擇性非甾體類芳香化酶抑制劑，通過(guò)抑制它的底物芳香化酶阻斷雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)換，降低雌二醇濃度，升高雄激素，導(dǎo)致無(wú)排卵[8]。本研究PCOS大鼠模型組特征與前期研究利用來(lái)曲唑灌胃法成功構(gòu)建 PCOS 大鼠模型報(bào)道相似[7,9]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用來(lái)曲唑誘導(dǎo)的大鼠模型無(wú)論是內(nèi)分泌、代謝紊亂方面，還是從卵巢解剖及組織學(xué)方面均與人類PCOS特征相似，是研究PCOS機(jī)制的理想動(dòng)物模型。

卵泡發(fā)育歷經(jīng)原始卵泡、竇前卵泡、竇卵泡，最終成為成熟卵泡這一系列過(guò)程中，卵泡液的形成及卵泡竇腔的擴(kuò)大有著極其重要的地位[10]。竇卵泡主要是通過(guò)顆粒細(xì)胞上的水通道實(shí)現(xiàn)水的轉(zhuǎn)運(yùn)，在卵泡發(fā)育過(guò)程中形成卵泡液，最終成為成熟卵泡[11]。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，AQP9主要表達(dá)于竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞中[11]，其參與了顆粒細(xì)胞的水轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與卵泡發(fā)育有關(guān)[12]。SALES等[13]研究認(rèn)為 AQP9在卵泡的發(fā)育中起著重要的作用。RIBEIRO等[12]對(duì)小鼠進(jìn)行超促排探究卵泡發(fā)育，過(guò)程中發(fā)現(xiàn)AQP9在卵泡快速發(fā)育階段表達(dá)明顯增加，且對(duì)AQP9進(jìn)行抑制發(fā)現(xiàn)卵泡體積明顯變小、排卵數(shù)減少，推測(cè)AQP9在卵泡腔迅速形成過(guò)程中促進(jìn)了水和其他物質(zhì)的大量納入，為卵泡的進(jìn)一步發(fā)育和成熟提供了環(huán)境和物質(zhì)基礎(chǔ)。

在PCOS患者卵巢內(nèi)存在大量的竇前卵泡、少數(shù)竇狀卵泡、眾多的閉鎖卵泡、濾泡囊腫和變性的囊腫。這些卵泡缺乏足夠多的成熟顆粒細(xì)胞，不能產(chǎn)生大量的雌激素，最終導(dǎo)致排卵障礙。另一方面，卵巢間質(zhì)和卵泡膜組織增生持續(xù)產(chǎn)生雄激素[14-15]。有研究報(bào)道，PCOS患者卵巢組織AQP9 mRNA表達(dá)明顯降低[2]。AQP9的表達(dá)可能是受雄激素調(diào)控[16]。一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者顆粒細(xì)胞中AQP9表達(dá)水平降低，這一改變可能與卵泡液中高雄激素有關(guān)，雄激素可降低顆粒細(xì)胞中AQP9基因和蛋白表達(dá)[5]。另一項(xiàng)研究也支持這個(gè)觀點(diǎn)，通過(guò)在母豬的卵巢進(jìn)行免疫組織化學(xué)定位發(fā)現(xiàn)，AQP9主要在正發(fā)育的顆粒細(xì)胞中表達(dá)，研究結(jié)果提示顆粒細(xì)胞中雄激素轉(zhuǎn)換為雌激素可能需要通過(guò)AQP9轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)[17]。此外，SONG等[6]發(fā)現(xiàn)AQP9廣泛分布在PCOS卵巢組織，PCOS壁層顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞中均有AQP9基因及蛋白質(zhì)，PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞AQP9的表達(dá)水平明顯下降。胰島素可能通過(guò)改變AQP9基因的表達(dá)，PCOS 卵巢局部高雄激素和高胰島素可使顆粒細(xì)胞增殖能力下降，從而導(dǎo)致其卵巢內(nèi)形成較多的初級(jí)卵泡，引起卵泡發(fā)育障礙[18-19]。推測(cè)過(guò)高的胰島素水平和雄激素可能會(huì)損害顆粒細(xì)胞的增殖功能，導(dǎo)致AQP9的低表達(dá)，從而引起卵泡發(fā)育障礙，這為探討PCOS患者的發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)潛在的新思路和治療的新靶點(diǎn)。本研究表明PCOS大鼠模型卵巢AQP9主要表達(dá)在卵巢顆粒細(xì)胞，定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，AQP9蛋白表達(dá)水平較正常組降低，這些特征符合PCOS患者在卵巢的表達(dá)特征。

綜上所述，來(lái)曲唑誘導(dǎo)的 PCOS 大鼠模型是符合 PCOS 病理生理機(jī)制的理想動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)和Western blot測(cè)定了PCOS大鼠卵巢AQP9的定位和蛋白的表達(dá)特點(diǎn)，但AQP9影響PCOS卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。