TGF-β1、HIF-1α在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義

李海飛，馮承保，劉錦燕

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居全身惡性腫瘤第3位，僅次于肺癌和胃癌，隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，嚴(yán)重威脅人們身心健康［1］。結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，容易因延誤病情而降低治療預(yù)后。探索結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對于臨床醫(yī)生擬定合理治療方案和改善患者預(yù)后具有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）是由細(xì)胞自分泌或旁分泌產(chǎn)生的多功能生物因子，能促進(jìn)細(xì)胞異質(zhì)化，加快腫瘤血管的生成［2］；缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）則是一種DNA結(jié)合蛋白，當(dāng)機(jī)體缺氧時，HIF-1α?xí)诩?xì)胞內(nèi)大量聚集［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和HIF-1α在肺癌、卵巢癌等腫瘤組織中表達(dá)量升高，參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移以及腫瘤血管生成過程，但兩者在結(jié)直腸癌病理中的具體作用機(jī)制尚不清楚［4］。本研究通過檢測結(jié)直腸癌及正常癌旁組織中TGF-β1、HIF-1α的表達(dá)，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為結(jié)直腸癌的治療提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1對象 收集2014年1月～2015年12月在保定市第二醫(yī)院就診并手術(shù)切除的80例結(jié)直腸癌患者病灶組織標(biāo)本，其中男性42例，女性38例；年齡41～78歲，平均（63.58±8.79）歲；結(jié)腸36例，直腸44例；高分化11例，中分化47例，低分化22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期52例。選取每例患者癌旁正常組織作為對照。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床病理學(xué)診斷確診為結(jié)直腸癌［5］；尚未接受放療、化療等治療措施；病理分期明確；臨床及病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心肝腎等臟器功能異常；合并免疫性疾病、血液疾病等；伴有息肉病、炎癥性腸病等腸道疾?。缓喜⑵渌到y(tǒng)腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤；已接受放化療而導(dǎo)致病理組織形態(tài)改變；臨床資料不完整，隨訪資料不全。

1.2方法 采集手術(shù)切除的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋備用。取出石蠟標(biāo)本，連續(xù)切片（厚4μm），60℃烤箱內(nèi)烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇浸泡水化，再以3%過氧化氫孵育請去除內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗抗原修復(fù)。加入山羊血清封閉30 min，加入TGF-β1、HIF-1α一抗，4℃孵育過夜；PBS溶液沖洗3次，滴加二抗，37℃孵育1 h；PBS溶液沖洗，加入DAB顯色液染色，蘇木精復(fù)染，然后脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下閱片。

每份切片隨機(jī)選10個200倍視野觀察，首先依據(jù)染色程度評分，不著色0分，黃色1分，棕黃色2分，深褐色3分；再依據(jù)染色細(xì)胞比例評分：≤25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。兩種評分乘積為免疫組化得分，≤4分判定為陰性，＞4分判定為陽性。

1.3隨訪 以電話或門診復(fù)查方式進(jìn)行定期隨訪，記錄研究對象出院后5年內(nèi)生存情況，隨訪截止至患者死亡或5年隨訪期結(jié)束。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以（%）表示，用χ2檢驗；采用Spearman法分析TGF-β1、HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性，應(yīng)用Kaplan-Meier曲線分析TGF-β1、HIF-1α表達(dá)與結(jié)直腸癌患者5年生存預(yù)后的關(guān)系；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同組織中TGF-β1、HIF-1α表達(dá)比較 結(jié)直腸癌組織中TGF-β1、HIF-1α表達(dá)陽性率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 結(jié)直腸癌患者不同組織中TGF-β1、HIF-1α表達(dá)比較［例（%）］

2.2結(jié)直腸癌組織中TGF-β1、HIF-1α表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡、病變部位、腫瘤直徑患者病灶組織中TGF-β1、HIF-1α陽性率相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；TGF-β1、HIF-1α表達(dá)陽性率與結(jié)直腸癌分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表2 TGF-β1、HIF-1α表達(dá)與病灶臨床病理特征的關(guān)系［例（%）］

2.3結(jié)直腸癌組織中TGF-β1、HIF-1α表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中TGF-β1與HIF-1α的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.475，P＜0.05）。經(jīng)過5年隨訪，80例結(jié)直腸癌患者生存45例，5年生存率為56.25%。TGF-β1陽性組生存率為49.15%，TGF-β1陰性組生存率為76.19%，兩組生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.204，P＜0.05）；HIF-1α陽性組生存率為47.17%，HIF-1α陰性組生存率為74.07%，兩組生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.535，P＜0.05）。

3 討論

結(jié)直腸腫瘤生長緩慢，早期無明顯癥狀，當(dāng)腫瘤較大時才會有梗阻、疼痛、消化道出血等癥狀，容易導(dǎo)致治療延誤［6-7］。腫瘤的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受內(nèi)、外多種因素影響，涉及組織學(xué)、形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)等方面，TGF-β1通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用［8］。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中TGF-β1陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織，且低分化、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高TNM分期患者腫瘤組織中TGF-β1表達(dá)量分別高于中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低TNM分期患者，提示TGF-β1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)量與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同TGF-β1表達(dá)患者5年生存率存在顯著差異，TGF-β1陽性表達(dá)患者5年生存率明顯降低，說明TGF-β1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有關(guān)，檢測病理組織中TGF-β1的表達(dá)能夠輔助評估患者預(yù)后。

HIF-1α是細(xì)胞在缺氧環(huán)境中表達(dá)的一種細(xì)胞因子，其活性不穩(wěn)定、半衰期短，常氧環(huán)境中HIF-1α能夠很快被降解，故而難以檢測到［9］。缺氧是實體瘤的重要特征，腫瘤組織細(xì)胞增殖活躍，腫瘤內(nèi)血管供血不足，導(dǎo)致腫瘤病灶內(nèi)缺氧［10］。在缺氧環(huán)境中，HIF-1α的降解途徑被阻斷，導(dǎo)致其大量聚集，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的缺氧耐受性，也會提高腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力；同時，HIF-1α能增強(qiáng)血管內(nèi)皮因子在缺氧狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)血管內(nèi)皮因子表達(dá)，參與瘤體內(nèi)新血管的生成，降低缺氧微環(huán)境對腫瘤組織的干擾［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，結(jié)直腸癌組織中HIF-1α陽性率明顯升高，且其陽性率與腫瘤組織分化程度、TNM分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示HIF-1α在結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可作為判斷腫瘤侵襲性、轉(zhuǎn)移風(fēng)險的參考指標(biāo)。另外，對比不同HIF-1α表達(dá)患者生存預(yù)后發(fā)現(xiàn)，HIF-1α陽性組生存率明顯低于陰性組，提示HIF-1α表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后密切相關(guān)，對早期評估患者預(yù)后具有一定幫助。

腫瘤的發(fā)生及發(fā)展受多種因素共同調(diào)節(jié)，腫瘤細(xì)胞生長導(dǎo)致局部微環(huán)境缺氧，刺激HIF-1α的產(chǎn)生和聚集，而HIF-1α又會激活血管內(nèi)皮因子，促進(jìn)瘤體內(nèi)血管新生，為腫瘤生長所需的營養(yǎng)供給提供基礎(chǔ)［12］。TGF-β1是獨立于缺氧外的一種促血管生長調(diào)節(jié)因子，能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)，促使內(nèi)皮細(xì)胞分化為腔管結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)腫瘤血管生成［13］。本研究分析80例惡性組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，47例標(biāo)本TGFβ1和HIF-1α的表達(dá)均為陽性，15例表達(dá)均為陰性，結(jié)直腸癌組織中TGF-β1與HIF-1α的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.475，P＜0.05）。提示TGF-β1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中表達(dá)存在相關(guān)性，兩者之間發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤血管生成，從而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中TGF-β1、HIF-1α表達(dá)與腫瘤生物學(xué)特征及預(yù)后有關(guān)，兩者之間可能存在相互作用，共同介導(dǎo)結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)直腸癌的早期診治提供了一定參考，但研究的樣本量較小，可能導(dǎo)致結(jié)果存在一定統(tǒng)計誤差，今后需增加樣本量，驗證研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。