酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

邱 黎

（南平市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所，福建南平 353000）

食品安全事關(guān)國民生計和人們的身體健康，其中食品微生物污染是導(dǎo)致食品安全問題的主要因素之一。細菌和真菌數(shù)量過多極容易造成食品的腐敗變質(zhì)，進而導(dǎo)致人們在食用后發(fā)生腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀，嚴(yán)重影響到人們特別是青少年的身體健康。為保障廣大消費者的飲食安全，必須科學(xué)合理地使用微生物檢測技術(shù)，杜絕微生物指標(biāo)超量的食品流入市場。因此，研究食品安全檢測過程中的微生物含量顯得尤為重要。本文綜述酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用與優(yōu)勢，使用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)快速識別和區(qū)分不同的微生物，為食品安全提供強有力的保障。

1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)概述

1.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)研究現(xiàn)狀

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）又稱為酶聯(lián)免疫法，是基于免疫酶技術(shù)發(fā)展形成的一種新型免疫測定技術(shù)[1]。該技術(shù)是繼免疫熒光、放射免疫技術(shù)之后，又重新建立的使用酶來標(biāo)記抗原或抗體的檢測技術(shù)。傳統(tǒng)病原微生物檢測方法主要采取分離培養(yǎng)或者生化試驗的方法，不僅需要人工操作，而且檢測周期較長。酶聯(lián)免疫吸附法極大地提高了檢測效率，這是由于酶具有較強的生物催化效果，一個酶分子在幾分鐘內(nèi)就可以催化出幾十甚至上百個底物分子，使得檢測效果放大，原來微乎其微的抗原或抗體在短時間內(nèi)就可以迅速標(biāo)識[2]。

酶聯(lián)免疫吸附法于1971 年被ENGVALL[3]首次提出，并發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑用于IgG 定量測定的文章，使得該技術(shù)發(fā)展成為液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的常用測定方法，而后國內(nèi)外眾多專家學(xué)者相繼研究這一領(lǐng)域，逐漸成為熱門前沿課題。1972 年，ENGVAIL 等[4]改用酶標(biāo)記免疫球蛋白，使標(biāo)記效率大幅度提高，進一步破解了半抗原標(biāo)記不夠準(zhǔn)確的問題，同時簡化了檢測過程。1975 年，KOHLER 等[5]開發(fā)生產(chǎn)的抗原特異性單克隆抗體技術(shù)，作為檢測復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的重要試劑，使抗體的制備水平達到一個新的高度。20 世紀(jì)90 年代以來，隨著免疫標(biāo)志物技術(shù)的快速發(fā)展，ELISA 技術(shù)得到了社會的廣泛認可，其靈敏度和特異性都有了顯著的提高，可實現(xiàn)對細菌、生物毒素、轉(zhuǎn)基因食品等方面的準(zhǔn)確 檢測。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)原理

ELISA 檢測技術(shù)主要采用酶分子和抗體或抗原相結(jié)合的方式，該技術(shù)既可以保持抗體本身的免疫學(xué)活性，也不影響酶的生物學(xué)活性。這種酶標(biāo)記的抗體能夠以物理形態(tài)吸附于固相載體表面，與載體表面抗原或抗體進行特異性反應(yīng)，通過與酶相融合產(chǎn)生酶的結(jié)合物，整個過程具有較強的免疫學(xué)活性。形成的酶結(jié)合物和抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，在加入底物溶液后，根據(jù)顯色的變化來判斷是否發(fā)生了免疫反應(yīng)，顯色變化的深淺與樣本中抗體或抗原呈正比關(guān)系。顯色的深淺程度需要通過ELISA 檢測儀進行精準(zhǔn)判斷，通過顯示試驗結(jié)果來確定樣品中待測物質(zhì)含量，這樣可以將酶的敏感性與抗原抗體的特異性更好地結(jié)合起來，使ELISA 檢測技術(shù)既符合特異性，又具有敏感性，以此達成檢測目的。

2 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的分類方法

根據(jù)反應(yīng)途徑的不同，ELISA 技術(shù)最常見的測定方法主要有直接測定法、間接測定法和雙抗夾心法等，每種測定技術(shù)都有其優(yōu)勢和不足，需要根據(jù)具體檢測的樣本、用途等選擇合適的方法。在ELISA測定方法中需要準(zhǔn)備3 種必要的試劑來保證測試的精準(zhǔn)，即固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體、酶作用的底物。ELISA 技術(shù)方法反應(yīng)示意見圖1。

圖1 ELISA 技術(shù)方法反應(yīng)示意

2.1 間接測定法

ELISA 間接法在所有方法中最為常用，該方法是對被試抗體通過酶標(biāo)記與固相結(jié)合，對被試抗體進行檢測，故稱為間接法。具體操作過程是將特異性抗原吸附于固相載體上，從而生成新的固相抗原，再加入需要檢測的樣本，抗體與固相抗原結(jié)合能夠生成復(fù)合物，再加入酶標(biāo)記的抗抗體與復(fù)合物相結(jié)合，通過沖洗，在固相中的生物活性即為特異性抗體的數(shù)目。最后加入底物顯色，由于每個過程都需要沖洗，如果檢測樣品中不含有對應(yīng)的這種抗體，酶標(biāo)抗體在這個階段就會被沖洗干凈，底物不顯色代表檢測結(jié)果呈陰性，如果檢測樣品中含有對應(yīng)的這種抗體，底物顯色則代表檢測結(jié)果呈陽性，染色深度代表樣品中檢測到的抗體數(shù)量。該方法的主要優(yōu)勢在于抗抗體可以加強信號，不加酶標(biāo)記的一級抗體則能夠保留免疫反應(yīng)性。其主要缺點是相比較于其他方法，交互反應(yīng)出現(xiàn)的概率上升。

2.2 直接測定法

直接法與間接法有所不同，是將特異性抗原吸附于固相載體上，從而生成固相抗原，加入酶標(biāo)記的一級抗體，樣品中的抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體相結(jié)合，結(jié)合的程度越好，酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合的機會就越小，加入底物后就不會顯色或者顯色很淺，即可測定抗原總量。該方法的主要優(yōu)勢在于操作過程簡單，因不需要使用抗抗體，能夠避免交互反應(yīng)。其缺點是試驗中的抗體都需要用酶來標(biāo)記，但并不是任何一種抗體都適合做標(biāo)記，且費用相對較高。

2.3 雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是將特異性抗體包附于固相載體上，經(jīng)沖洗一次后，加入含有酶標(biāo)記抗原的待檢測樣本，如兩者具有特異性則發(fā)生反應(yīng)，再加入與待測抗原呈特異反應(yīng)的酶聯(lián)抗體，使一單位的抗原同時結(jié)合兩單位的抗體由此形成“夾心”，再加入底物顯色進行測試，根據(jù)有色酶解產(chǎn)物顏色有無和深淺變化，確定待測試抗原的含量。該方法的優(yōu)點在于靈敏度高、專一性強，抗原不需要提前進行純化，但缺點是雙抗體夾心法常用于檢測二價或二價以上的大分子抗原，對于半抗原及小分子單價抗原檢測的準(zhǔn)確性不足，這是因為該方法的抗原需要擁有至少兩個或兩個以上的抗體結(jié)合部位，但半抗原及小分子單價抗原不能形成兩位點夾心，故檢測效果不明顯。

3 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

酶聯(lián)免疫吸附試驗在食品毒害物質(zhì)的檢測中有著良好的應(yīng)用效果，食品微生物檢驗內(nèi)容主要包括菌落總數(shù)、大腸桿菌、霉菌、沙門氏菌等致病菌檢驗，可實現(xiàn)對食品細菌、真菌毒素的檢測。

3.1 細菌的檢測

傳統(tǒng)的細菌檢測方法主要是采取培養(yǎng)、生化試驗、病原學(xué)檢查等手段進行，但由于其操作煩瑣、檢測時間長、主觀判斷復(fù)雜、工作量大以及容易疏忽，難以滿足現(xiàn)代工業(yè)對食品中細菌的檢測需求。ELISA 技術(shù)在食品安全領(lǐng)域檢測中的應(yīng)用，可有效對食品中的沙門氏菌、大腸桿菌、軍團菌和金黃色葡萄球菌等細菌進行檢測。以沙門氏菌為例，該細菌是一種常見的食源性致病菌，是食品安全檢測中的關(guān)鍵指標(biāo)。國內(nèi)外大量研究證實，沙門氏菌已成為引發(fā)細菌性食物中毒事件的主要致病菌。1977 年，KRYINSKI 等[6]首次將酶聯(lián)免疫吸附檢測法應(yīng)用在食品中沙門氏菌的檢測，并取得了較好的實驗效果。而后陸續(xù)有大量專家利用ELISA 技術(shù)對食品中是否含有過量的沙門氏菌開展了研究，但由于他們大多數(shù)使用的是多價抗血清，在測試中經(jīng)常會出現(xiàn)交叉反應(yīng)，使得測試結(jié)果出現(xiàn)假陽性。到20 世紀(jì)80 年代，隨著單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)的日益成熟，解決了一系列單抗應(yīng)用中存在的難點問題，形成了抗沙門氏菌的各類O 型抗原、H 型抗原單抗，代替常規(guī)血清進行檢測，并體現(xiàn)出ELISA 檢測的優(yōu)勢性能。

文其乙等[7]利用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，選用CB8及De7 兩株單抗相合成酶標(biāo)檢測試劑，建立了沙門氏菌的高效檢測方法。該方法可以在48 h 內(nèi)完成對5 CFU/25 g 肉類樣品的快速檢測，敏感性達到99%，特異性達到100%。馬杰華[8]的研究表明，酶聯(lián)免疫吸附法可在很大程度上縮短檢測時間，僅需22 h 可實現(xiàn)自動測試。段悅慶等[9]采用夾芯式酶聯(lián)免疫吸附法組裝了檢測試劑盒，并對大腸桿菌進行了ELISA 測試，結(jié)果顯示，均未與其他菌株發(fā)生交叉反應(yīng)；對雞肉、牛肉等樣本敏感性測試，其檢出限在0.4 ～4.0 CFU·g-1，試劑盒的敏感性、特異性、精密性均達到預(yù)期要求。另外，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)還可實現(xiàn)對水果中耐熱細菌的檢測。肖鋼軍等[10]利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測金黃色葡萄球菌，其檢測周期僅為18 h，檢出率達到1 CFU·g-1。

3.2 真菌毒素的檢測

真菌毒素屬于一種自然界天然存在的有毒化學(xué)物質(zhì)，可在飼料和不同農(nóng)作物上生長，隨著食物鏈殘留在家禽、肉和牛奶等食品中，不僅對人體具有毒性、致癌、致畸等嚴(yán)重危害，而且還對腎臟、肝臟、免疫系統(tǒng)造成不可逆的影響。由于真菌毒素在人體內(nèi)積累會對身體健康產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，大部分國家和地區(qū)都制定了嚴(yán)格的法律法規(guī)，對食品中殘留的真菌毒素最高限量進行嚴(yán)格控制。常見的食品污染真菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、T-2 毒素等，他們主要殘存在小麥、大米、玉米和花生等食品中。

以黃曲霉毒素為例，該毒素是一種由黃曲霉、寄生曲霉等真菌所產(chǎn)生的次生代謝物，主要存在于花生、玉米、乳及乳制品等糧油和動植物食品中，具有極強的致病力和致癌性，國際癌癥研究組織已經(jīng)把黃曲霉毒素列入全球一類致癌物名錄。早在1977年，WOLTERS 等[11]就開始應(yīng)用ELISA 技術(shù)對黃曲霉毒素進行檢測，利用小分子將黃曲霉毒素B1與蛋白免疫動物結(jié)合，成功制備出黃曲霉B1的酶標(biāo)復(fù)合物，為今后黃曲霉毒素檢測提供了重要的理論依據(jù)。而后陸續(xù)有專家學(xué)者不斷效仿，并在此基礎(chǔ)上嘗試新的技術(shù)創(chuàng)新。孫清等[12]通過使用牛血清白蛋白、雞卵清蛋白、辣根過氧化物酶等試劑，制得黃曲霉毒素B1免疫原，對食品樣品中的黃曲霉毒素B1進行檢測，成功研制了用于檢測玉米、豆粕和魚粉樣品的高靈敏試劑盒，檢測限可達7.6 pg·mL-1，樣品平均回收率達到108.4%～134.8%。姚靜靜等[13]制備了具有高靈敏度的黃曲霉毒素B1單克隆抗體，并采用ELISA 間接檢測技術(shù)對糧食和飼料中是否含有黃曲霉毒素進行檢測，黃曲霉毒素B1單克隆抗體的效價達到5.12×105，檢測范圍在0.014 ～1.920 ng·mL-1，說明該檢測方法具有較強的可靠性。

3.3 食品介導(dǎo)病毒檢測

ELISA 技術(shù)還可用來檢測食品中的介導(dǎo)病毒，其主要檢測食品從業(yè)人員甲肝、乙肝病毒攜帶等感染情況。目前，已有的文獻資料表明病毒感染與克山病關(guān)系密切，尤其以柯薩奇B 組病毒居多。黃漢菊等[14]采用ELISA 技術(shù)檢測了四川省30 例患有克山病人的血清，選取非病區(qū)10 名人員作為比照，結(jié)果表明克山病組血清抗體陽性率明顯高于非病區(qū)人員樣本，驗證了潛、慢型克山病患者有柯薩奇B 組病毒感染的存在。

4 結(jié)語與展望

在食品微生物檢測中，ELISA 技術(shù)作為一種簡單、快速、高效的檢測方法，體現(xiàn)出了其巨大的應(yīng)用價值，已成為一種新的研究方向。本文結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品檢驗中的應(yīng)用現(xiàn)狀，探討其應(yīng)用途徑，對于保障人們的食品安全具有一定的借鑒作用。ELISA 技術(shù)在食品微生物檢測中具有良好的應(yīng)用效果，逐漸成為食品領(lǐng)域微生物檢測最有效的分析工具，實現(xiàn)了極低濃度水平下食源性致病菌的檢測，滿足食品安全國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中對微生物限量的檢測需求，但目前國內(nèi)技術(shù)還不完善，要積極學(xué)習(xí)國外先進經(jīng)驗，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，為我國食品安全管理工作提供可靠依據(jù)。隨著蛋白質(zhì)、基因工程等科學(xué)水平的不斷發(fā)展，抗體的制備技術(shù)也將越來越成熟，未來ELISA 的檢測效率將獲得更大的提升。