6 種增稠劑對(duì)野生型果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的影響研究

汪曉純，袁紫儀，顧 悅，郭慶宇，王 濤，續(xù)凱欣

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江大慶 163000；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧沈陽 110866；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

近年來，在國(guó)家和科研工作者的努力下，食品添加劑的開發(fā)取得了質(zhì)的飛躍，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)已有多種特殊功能的天然食品添加劑和人工合成的食品添加劑。食品添加劑就是一把雙刃劍，既有優(yōu)點(diǎn)也有缺點(diǎn)。食品添加劑增加了食品的種類，保持和提升了食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但是一些食品添加劑在使用過程中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，有些副產(chǎn)物在人體內(nèi)累積到一定程度，會(huì)使人體機(jī)能受到損害；且食品添加劑的超范圍、超劑量使用也會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生巨大的安全隱患。由此可見，食品添加劑與人體健康息息相關(guān)，已經(jīng)成為一項(xiàng)威脅人體健康不可忽視的因素。其中，增稠劑主要用于改善和增加食品的黏稠度，保持流態(tài)食品、膠凍食品的色、香、味和穩(wěn)定性，改善食品物理性狀，并能使食品有潤(rùn)滑適口的感覺[1-5]。因此，食品中應(yīng)用各種增稠劑的安全性也亟待驗(yàn)證，以便更好地應(yīng)用于食品工業(yè)。

黑腹果蠅是生物學(xué)研究中最重要的模型生物之一，具有體積小、易于操作、飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、成本低廉、生命周期短（約兩周）、繁殖力強(qiáng)以及子代數(shù)量多等優(yōu)勢(shì)。超過60%的人類疾病基因在果蠅中有直系同源物。因此，20 世紀(jì)70 年代以來，黑腹果蠅在發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、人類疾病研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，隨著科學(xué)的發(fā)展和研究手段的不斷進(jìn)步，在未來果蠅將會(huì)作為一種理想的模式生物在各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮其作用[6-7]。本研究通過喂食果蠅6 種增稠劑，并觀察果蠅的體積、體重、爬行能力和后代存活率等指標(biāo)分析增稠劑對(duì)果蠅生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基的配制

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）挑選10 種增稠劑，經(jīng)過梯度濃度增稠劑配制果蠅培養(yǎng)基篩選，以50 只雌果蠅產(chǎn)卵兩天，孵化成蟲數(shù)量達(dá)到50 只以上為標(biāo)準(zhǔn)，最終得到6 種增稠劑的果蠅培養(yǎng)數(shù)據(jù)。

培養(yǎng)基配制采用2x 果蠅濃縮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋配制，基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 L 成分為玉米粉71.2 g、酵母粉16.8 g、黃豆粉9.8 g、瓊脂5.6 g、水600 mL、麥芽糖飴75 mL、麥芽汁400 mL 等。對(duì)照組為2x 培養(yǎng)基∶水=1 ∶1 稀釋配制；實(shí)驗(yàn)組為2x 培養(yǎng)基∶增稠劑水溶液=1 ∶1 混合配制，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基增稠劑的最終濃度分別為5%紫膠酸、5%蔗糖硬脂酸酯、3%卡拉膠、3%羅望子膠、3%藻酸丙二醇酯和3%海藻酸鈉。接種果蠅為w1118野生型果蠅，50 只雌果蠅，50 只雄果蠅接卵48 h，25 ℃培養(yǎng)，濕度60%，12 h 晝夜交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

解剖鏡，日本Olympus；正置熒光顯微鏡，德國(guó)Leica；電子分析天平，上海恒平儀器；純水儀，上海雷磁電科學(xué)儀器；生化培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯(lián)儀器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 三齡幼蟲的發(fā)育情況測(cè)定

收集在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)卵4 d 后孵化的三齡幼蟲，冷凍處理14 h 后放置于干凈的載玻片上，用毛刷將其擺放整齊，每組收集20 只在顯微鏡下拍照，用刻度尺測(cè)量并拍照記錄。根據(jù)以下公式計(jì)算蛹的相對(duì)體積V1。

式中：L1為三齡幼蟲長(zhǎng)度，mm；I1為三齡幼蟲寬度，mm。

1.3.2 蛹的發(fā)育情況

收集不同培養(yǎng)基中已經(jīng)孵化成蛹的果蠅，放置于干凈的載玻片上，用毛刷將其擺放整齊，每組20只在顯微鏡下拍照并記錄。根據(jù)以下公式計(jì)算蛹的相對(duì)體積V2。

式中：L2為蛹長(zhǎng)度，mm；I2為蛹寬度，mm。

1.3.3 成蟲爬行能力的測(cè)定

根據(jù)李娜等[8]測(cè)定果蠅的爬行能力的方法，收集不同培養(yǎng)基中羽化后的雄性成蟲取20 只分別放入量筒中，將果蠅磕至空量筒底部，并同時(shí)開始計(jì)時(shí)至15 s 時(shí)，數(shù)出15 s 時(shí)果蠅爬過12 cm 線的只數(shù)，每組做3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 雄性成蟲果蠅重量的測(cè)定

收集不同培養(yǎng)基中羽化后的雄性成蟲，每組樣品取20 只，使用分析天平稱重記錄數(shù)據(jù)，每組做3次平行實(shí)驗(yàn)。成蟲平均體重=總質(zhì)量/稱重只數(shù)。

1.3.5 雌果蠅受精卵的孵化率的測(cè)定

收集不同培養(yǎng)基中雌性果蠅20 只，將其放在蘋果汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，記錄其產(chǎn)卵數(shù)，4 ～5 d 后記錄其孵化卵數(shù)。計(jì)算出果蠅的孵化率，每組做3 次平行實(shí)驗(yàn)。孵化率=（孵化數(shù)/產(chǎn)卵總數(shù)）×100%。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

果蠅顯微圖像采用ImageJ 軟件分析測(cè)量果蠅幼蟲和蛹的長(zhǎng)度和寬度；GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 增稠劑對(duì)果蠅個(gè)體體積的影響

2.1.1 三齡幼蟲期

果蠅從受精卵孵化成一齡幼蟲僅需24 h，從一齡幼蟲期到達(dá)三齡幼蟲期需2 ～3 d，三齡幼蟲的形體狀態(tài)穩(wěn)定，便于觀察與測(cè)量[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在幼蟲期增稠劑卡拉膠、羅望子膠、藻酸丙二醇酯和海藻酸鈉的體積顯著減小（圖1）。其中羅望子膠組體積下降28.4%，卡拉膠組下降21.8%，海藻酸鈉組下降16.5%，藻酸丙二醇酯組下降了10.3%。另外，紫膠組和蔗糖硬脂酸酯組幼蟲體積分別增加38.3%，65.2%（表1）。研究結(jié)果表明不同增稠劑對(duì)果蠅幼蟲期的大小影響存在差異。

表1 喂食增稠劑果蠅幼蟲體積變化

圖1 增稠劑喂食果蠅的三齡幼蟲狀態(tài)（標(biāo)尺為500 μm）

2.1.2 蛹期

果蠅變態(tài)發(fā)育的第二個(gè)階段為蛹期，此階段的果蠅大小直接決定成蟲體型，通過進(jìn)一步觀察果蠅蛹體積的大小，分析增稠劑對(duì)果蠅生長(zhǎng)的影響至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，卡拉膠組減少53.3%，羅望子膠組減少42.4%，海藻酸鈉組減少了38.1%，藻酸丙二醇酯減少了25.8%。此外，紫膠組和蔗糖硬脂酸酯蛹體積分別增加了34.7%和32.5%（圖2 和表2）。通過幼蟲與蛹的體積分析，發(fā)現(xiàn)增稠劑紫膠和蔗糖硬脂酸酯對(duì)果蠅的生長(zhǎng)起到了持續(xù)促進(jìn)的效果，而卡拉膠、羅望子膠、藻酸丙二醇酯和海藻酸鈉抑制了果蠅的幼蟲期與蛹期的生長(zhǎng)。

圖2 增稠劑喂食果蠅的蛹期狀態(tài)（標(biāo)尺為500 μm）

表2 喂食增稠劑的蛹體積變化

2.2 增稠劑對(duì)成蟲體重的影響

果蠅經(jīng)過幼蟲期和蛹期的生長(zhǎng)最終羽化成成蟲，成蟲繼續(xù)在增稠劑培養(yǎng)基中生活7 d。由于雌性成蟲受激素的影響較大，因此選擇羽化7 d 的雄果蠅測(cè)量體重，持續(xù)觀察增稠劑對(duì)果蠅體重的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比卡拉膠組、羅望子膠組和海藻酸鈉組的平均體重分別下降了0.11 mg、0.09 mg和0.12 mg，而紫膠組和蔗糖硬脂酸酯組的平均體重分別增加了0.10 mg 和0.05 mg（圖3）。因此，增稠劑對(duì)果蠅的生長(zhǎng)影響持續(xù)到了成蟲期，而不同的增稠劑的影響效果不同。

圖3 增稠劑對(duì)成蟲期雄果蠅的體重影響

2.3 增稠劑對(duì)果蠅后代存活能力的影響

為了進(jìn)一步觀察增稠劑對(duì)果蠅后代存活率的影響，通過分別搜集200 只雌果蠅，50 只雄果蠅自由交配48 h，計(jì)算產(chǎn)卵的孵化率。結(jié)果顯示，增稠劑組的后代活力顯著下降，與對(duì)照組的93.2%的孵化率相比，紫膠組下降了28.2%，蔗糖硬脂酸酯組下降了12.2%，卡拉膠組下降了11.2%，羅望子膠組下降了37.1%，藻酸丙二醇酯組下降了52.4%，海藻酸鈉組下降了14.1%（圖4）。以上結(jié)果說明，增稠劑對(duì)于后代的存活率的影響嚴(yán)重，可較大程度地降低受精卵的孵化率。

圖4 增稠劑對(duì)成蟲后代的存活能力的影響

2.4 增稠劑對(duì)果蠅成蟲行為能力的影響分析

爬行能力是果蠅運(yùn)動(dòng)活力的關(guān)鍵，通過觀察果蠅的爬行能力，可以分析增稠劑對(duì)果蠅的機(jī)械活動(dòng)能力的影響，進(jìn)一步評(píng)價(jià)果蠅的生長(zhǎng)狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)量20 只雄果蠅15 s 內(nèi)爬過12 cm 距離的通過率分析果蠅的爬行能力。研究結(jié)果表明，喂食增稠劑的實(shí)驗(yàn)組果蠅成蟲的爬行能力受到不同程度的影響，其中紫膠組的通過率下降了22.8%，蔗糖硬脂酸酯組下降了27.8%，卡拉膠組下降了61.1%，羅望子膠組下降了47.8%，藻酸丙二醇酯組下降了54.5%，海藻酸鈉組通過率下降了40.1%（圖5）。以上結(jié)果說明，增稠劑抑制了果蠅的運(yùn)動(dòng)能力，通過率普遍降低。

圖5 增稠劑對(duì)果蠅爬行能力的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究表明，喂食果蠅6 種增稠劑對(duì)果蠅幼蟲期、蛹期與成蟲期的生長(zhǎng)發(fā)育存在不同程度的影響，其中卡拉膠、羅望子膠和海藻酸鈉顯著抑制了果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育。表現(xiàn)為幼蟲和蛹的體積變小、體重下降、后代存活率降低以及爬行能力降低。在食品工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用此種增稠劑存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)，為進(jìn)一步規(guī)范使用食品添加劑提供理論參考。