黃曲霉毒素檢測方法研究進展

紀文華，李雪梅，尹小燕，韓浩月，喬曌宇，張麗丹，苗 冉，馬晗雪，明郁斐

1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)山東省分析測試中心 山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點實驗室,山東 濟南 250014 2.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)藥學院，山東 濟南 250014 3.日照市生態(tài)環(huán)境局，山東 日照 276800

黃曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)是寄生曲霉(Aspergilusparasiticus)、黃曲霉(Aspergillusflavus)等的代謝產(chǎn)物，廣泛存在于霉變的谷物、花生、大米和果仁等食物中，食用油、乳制品等食品中也經(jīng)常檢出黃曲霉毒素[1]。黃曲霉毒素是一類毒性極強的劇毒物質(zhì)，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)劃定為天然存在的1類致癌物[2]。因此，分析測定食品中黃曲霉毒素的含量對保障食品質(zhì)量安全具有極其重要的意義。

1 黃曲霉毒素概況

黃曲霉毒素是一組雜環(huán)二呋喃和香豆素骨架的天然化合物，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2以及次級代謝產(chǎn)物AFM1、AFM2被認為是食品和飼料的重要污染物[3]。黃曲霉毒素在水、乙醚、乙烷中不溶，在甲醇、乙腈和氯仿等有機溶劑易溶解，耐熱性極強，一般烹調(diào)溫度難以破壞，280～300 ℃才可使其裂解[4]。此外，黃曲霉毒素不耐堿，在pH 9～10會迅速分解，部分毒素失去活性[5]。在紫外光照射下，AFB1、AFB2發(fā)藍色熒光，AFG1、AFG2發(fā)綠色熒光[6]。

黃曲霉毒素廣泛存在于谷物類(玉米、小麥、稻谷、高粱等)、堅果類(花生、核桃、杏仁等)、糧油、中藥材以及乳制品內(nèi)，對人類健康造成嚴重威脅。其中AFB1被世界衛(wèi)生組織認定為1類致癌物，是目前發(fā)現(xiàn)毒性最強的真菌毒素，其毒性比氰化鉀高10倍、砒霜高68倍[7]。短期內(nèi)吸入大量黃曲霉毒素會造成嚴重的肝功能損傷，長期接觸則容易造成急性或慢性疾病甚至癌癥[8]。除此之外，孕婦若長期攝入受到AFB1污染的食物，輕則會阻礙胎兒生長，造成胎兒先天性異常，重則會導致孕婦出現(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)和死產(chǎn)等問題[9]。其他類型的黃曲霉毒素毒性和致癌性僅次于AFB1。

黃曲霉毒素存在范圍廣，危害性大，為了維護人類健康，預防黃曲霉毒素中毒事件的發(fā)生，諸多國家和地區(qū)對食品中黃曲霉毒素的含量有嚴格限量要求。歐盟EC(NO)165/2010《食品中特定污染物的最大殘留限量》規(guī)定，在所有谷類產(chǎn)品中，AFB1含量不得高于2 μg/kg。日本《食品衛(wèi)生法》要求，AFB1在任何食品中不得被檢出。根據(jù)GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》規(guī)定，AFB1的含量在玉米、花生中不能高于20 μg/kg，在稻谷、花生油中不能高于10 μg/kg,在小麥、大麥、發(fā)酵豆制品和其他熟制堅果中不得高于5 μg/kg，在乳制品、嬰幼兒食品中不得高于0.5 μg/kg。

2 黃曲霉毒素的檢測方法

2.1 儀器分析

2.1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)是實驗室檢測黃曲霉毒素最常用的方法，主要包括提取、凈化和檢測3個步驟[10]。Shuib等[11]采用HPLC結(jié)合柱后光化學衍生熒光檢測牛奶中的黃曲霉毒素M1(AFM1)。使用甲醇-水(體積比35∶ 65)作為流動相，C18色譜柱在40 ℃等度洗脫，熒光檢測器(fluorescence detector，F(xiàn)LD)分別設(shè)置360 nm和440 nm作為激發(fā)和發(fā)射波長，隨后進行衍生化處理，采用高效液相色譜儀分析，得到樣品檢出限(limit of detection，LOD)和定量限(limit of quantitation，LOQ)分別為0.002 μg/L和0.004 μg/L，回收率為85.2%～107.0%，所提出的方法可用于測定各種類型的牛奶和奶制品中的AFM1，且光化學衍生法不需要危險性和含氯溶劑，對環(huán)境友好。

適配體是一種新型的靶識別元件，具有特異性強、親和力高等優(yōu)點。Zhao等[12]采用適配體親和柱(aptamer affinity column，AAC)結(jié)合HPLC對蓮子中的AFB1進行了特異性富集和鑒定。通過優(yōu)化負載量和洗脫條件，提高了AFB1-AAC的最大樣品容量，并用其他真菌毒素作為干擾物質(zhì)考察了親和柱的選擇性，結(jié)果顯示親和柱對其他真菌毒素沒有吸附作用。采用高效液相色譜-熒光檢測(high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD)結(jié)合適配體親和柱凈化的光化學反應(yīng)器分析蓮子中AFB1的含量，LOD為0.05 ng/mL，回收率為91.8%～108.6%。另外，適配體親和柱重復使用20次后仍對AFB1具有較好的親和力。該結(jié)果為食品、農(nóng)產(chǎn)品和中藥等復雜基質(zhì)中微量毒素的富集和檢測提供了一種新方法。

HPLC雖然成本低、靈敏度高且應(yīng)用范圍廣，但需要實驗人員進行復雜的樣品前處理，而且分析方法耗費時間，僅適用于實驗室，不適用于大量樣品現(xiàn)場分析[13]。

2.1.2 質(zhì)譜檢測法

液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatogram tandem mass spectrometry，LC-MS)以液相色譜做分離，質(zhì)譜做檢測，通過兩者有機結(jié)合，從而對樣品中的成分進行定量和定性分析。近年來，LC-MS在食品安全[14]、環(huán)境檢測[15]和藥物分析[16]等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，目前也已被應(yīng)用到真菌毒素的篩查檢測中[17]。

Ye等[18]開發(fā)了一種多功能純化柱(multifunctional purification column，MFC)和免疫親和柱(immunoaffinity column，IAC)串聯(lián)結(jié)合LC-MS/MS對黑茶中4種真菌毒素(AFB1、AFB2、AFG1及AFG2)進行同步檢測。樣品首先經(jīng)乙腈-水(體積比84∶ 16)萃取，然后用MFC-IAC串聯(lián)凈化，從而大大減少基體干擾，該方法對4種AFT的LOD為0.024～0.21 μg/kg。與HPLC法相比，LC-MS/MS方法靈敏度高、特異性強。

為了進一步簡化樣品前處理步驟，Chen等[19]開發(fā)了一種免疫磁珠與LC-MS分析相結(jié)合的一步自動樣品前處理方法，即將提取、捕獲、清洗和洗脫過程結(jié)合為一步，構(gòu)建了一個帶有免疫磁珠的多功能自動樣品前處理平臺，用于檢測牛奶中的AFM1。免疫磁珠通過AFM1抗體對磁珠的特異性親和力，可以快速識別和富集樣品中的AFM1，然后進行LC-MS分析。該方法的LOD為0.000 8 μg/kg，LOQ為0.002 7 μg/kg。同時，使用免疫磁珠的樣品前處理方法可以有效縮短處理時間，提高分析效率，降低誤差。

LC-MS方法具有分離能力強、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點，能夠滿足食品中AFT檢測要求，但儀器成本較高，且需要測試人員具備一定的專業(yè)知識，只適用于實驗室檢測，不能滿足現(xiàn)場檢測的需求。因此，開發(fā)一種操作簡單、成本低廉、可適用于現(xiàn)場檢測的LC-MS技術(shù)已成為未來研究重點。

2.2 免疫分析

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是醫(yī)學診斷實驗室和研究機構(gòu)快速篩查黃曲霉毒素最常用的方法，其基本原理是將待測物的抗原(抗體)吸附于某種固相載體表面，加入酶標記的抗體(抗原)使其發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，再加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩孜?，故可根?jù)顏色的深淺進行定量或定性分析[20]。

為了進一步提高ELISA檢測靈敏度，Ren等[21]建立了一種基于納米抗體(克隆G8)與納米熒光素酶(Nanoluciferase，Nluc)融合的競爭性生物發(fā)光ELISA，檢測谷物中的AFB1。將抗AFB1的納米體(克隆G8)與Nluc融合并克隆到pET22b表達載體中，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。通過稀釋樣品溶液濃度減少基質(zhì)干擾，從而使融合蛋白G8-Nluc具有納米體結(jié)合能力和熒光素酶催化活性。利用生物發(fā)光這種高靈敏度形式可補償提取后樣品稀釋過程中的靈敏度損失。與經(jīng)典ELISA相比，該方法可以將檢測靈敏度提高20倍以上，半抑制濃度(IC50)為0.41 ng/mL，線性范圍為0.10～1.64 ng/mL。此外，從樣品制備到數(shù)據(jù)分析，整個檢測過程可以在2 h內(nèi)完成。

傳統(tǒng)的ELISA容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[22]，為了避免出現(xiàn)此類現(xiàn)象，Xu等[23]建立了一種基于金屬有機框架(MOF)的間接競爭性ELISA用于AFT的高靈敏檢測。用功能化MOF替代傳統(tǒng)ELISA中的天然酶，可以解決傳統(tǒng)天然酶催化活性低、穩(wěn)定性差等問題，同時采用催化顯色系統(tǒng)，檢測方法的LOD為0.009 ng/mL。與傳統(tǒng)ELISA相比，該檢測方法的LOD提高了20倍，回收率和RSD分別為86.41%～99.74%和2.38%～9.04%，均優(yōu)于傳統(tǒng)的ELISA，可以有效降低假陽性結(jié)果的概率。

近年來，由于ELISA檢測具有操作便捷、靈敏度高、特異性好、價格優(yōu)廉等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用到食品安全檢測[24]、藥物殘留分析[25]等領(lǐng)域。但在實際樣品檢測中避免假陽性仍然存在巨大挑戰(zhàn)，且用于標記的抗體酶的純度容易受環(huán)境影響導致穩(wěn)定性降低，影響檢測結(jié)果[26]。

2.2.2 時間分辨熒光免疫分析法

時間分辨熒光免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)采用鑭系元素及其螯合劑作為標記物，利用鑭系元素螯合物的熒光特性，通過時間分辨熒光測定儀對該體系進行熒光強度的測定，從而確定待分析物的含量，可有效消除非特異熒光的干擾，提高分析結(jié)果靈敏度[27]。

為了進一步提高TRFIA的靈敏度以滿足痕量檢測的要求，Tang等[28]利用時間分辨免疫色譜分析法(time-resolved fluorescence immunochromatographic assay，TRFICA)快速、定量檢測玉米及其制品中的AFB1和玉米赤霉烯酮(ZEN)。首先，通過制備具有增強熒光的新型Eu/Tb(Ⅲ)納米球作為標記物，進而與抗獨特型納米體(anti-idiotypic nanobody，AIdnb)和單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)結(jié)合，建立了兩種競爭性時間分辨條帶法(AIdnb-TRFICA和mAb-TRFICA)并進行比較，AIdnb-TRFICA可同時檢測AFB1和ZEN。結(jié)果顯示，AIdnb-TRFICA對AFB1和ZEN的靈敏度分別比mAb-TRFICA高18.3倍和20.3倍，AIdnb-TRFICA方法回收率為72.6%～106.6%，AFB1的LOD為0.05 ng/mL，ZEN的LOD為0.07 ng/mL。

Li等[29]通過時間分辨熒光微球免疫層析試紙條實現(xiàn)了牛奶及其制品中AFM1快速測定。首先，將銪(Ⅲ)嵌入聚苯乙烯得到時間分辨熒光微球。然后，將微球與單克隆抗體結(jié)合，在37 ℃進行10 min的預培養(yǎng)，隨后與免疫層析試紙條組裝。在最優(yōu)條件下，測試方法的LOD達0.019 ng/mL，比使用量子點和金納米粒子獲得的LOD低5倍，靈敏度與金納米顆粒試紙方法相比提高近16倍，變異系數(shù)小于8.31%，回收率為84.6%～119.0%，此外，整個測試過程約為 20 min，且試紙的保存時間較長，基本符合商業(yè)市場的要求。

TRFIA技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、重復性好、性價比高等優(yōu)點，近幾年已逐漸應(yīng)用于食品檢測[30]、環(huán)境分析[31]等領(lǐng)域，而且已在國際超微量分析領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景[32]。但TRFICA采用的鑭系元素具有放射性，因此長期接觸會對測試人員造成人體傷害，使用過程中也可能會造成環(huán)境污染。此外，螯合劑的熒光壽命較短，容易產(chǎn)生背景干擾，且多為有毒物質(zhì)，不利于人體健康[33]。

2.3 其他分析

2.3.1 薄層色譜法

薄層色譜法(thin layer chromatographic technique，TLC)又稱薄層層析技術(shù)，是指將固定相吸附劑均勻地涂于支持板上形成薄層板，然后用相應(yīng)的溶劑展開，從而對混合樣品實現(xiàn)分離和鑒定[34]。TLC是最早使用的一種檢測AFT的方法，隨著該技術(shù)的不斷進步與發(fā)展，檢測的準確率和簡便性也在逐漸提高[35]。

馮莉[36]采用石油醚-甲醇混合液(體積比為30∶ 100)作萃取劑，無水乙醚、丙酮、三氯甲烷(體積比為10∶ 8∶ 92)作展開劑，通過薄層色譜法來檢測玉米中的AFB1，用波長365 nm紫外光對AFB1進行定性檢測。Salisu等[37]開發(fā)了一種新的溶劑系統(tǒng)和薄層色譜法，用于定性測定食品和家禽飼料中的AFT。該方法采用甲醇-水(體積比75∶ 25)加5%的氯化鈉混合溶液進行萃取，乙腈-二氯甲烷(體積比3∶ 17)作流動相對AFT進行檢測分析。該方法的LOD< 2 ng/g，LOQ< 4.0 ng/g，回收率為74%～105%。該方法可能成為測定食品和飼料中AFT的常規(guī)技術(shù)，尤其是在無法使用色譜與質(zhì)譜儀器的實驗室。

薄層色譜法具有操作簡便、直觀快速、設(shè)備簡單的特點，并且可以同時處理多個樣品，但容易受溫度和濕度影響，導致對于生物高分子的分離效果并不是很好，準確性和穩(wěn)定性亦不高[38]。未來將會尋求更好的固定相和展開劑，同時也可以和新的儀器技術(shù)聯(lián)用，使TLC成為一種靈敏、高效的分離與分析方法。

2.3.2 表面增強拉曼光譜法

表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是一種將被測分子吸附在諸如金、銀和銅等金屬顆粒上，使拉曼信號增強105～1015倍的振動光譜技術(shù)[39]。SERS可提供精細的分子指紋，允許直接識別目標分析物，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化學、物理、材料和生物醫(yī)學等研究領(lǐng)域[40]。

Liu等[41]采用QuEChERS聯(lián)用SERS法用于糧食中的AFB1高靈敏檢測，該方法以金納米粒子溶液(金溶膠)作為SERS檢測基底，集樣品制備和提取一體化，減小了基質(zhì)干擾，簡化了操作流程，整個過程僅需10 min，LOD和LOQ分別可達0.85 μg/kg和2.83 μg/kg。另外，其他真菌毒素沒有顯著的SERS信號，證實該方法對AFB1具有高選擇性。重要的是，整個SERS實驗過程不需要任何分子標記，同時適用于批量樣品檢測以及現(xiàn)場檢測，在食品安全領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。

Qu等[42]采用TLC結(jié)合SERS法用于霉變農(nóng)產(chǎn)品中的痕量AFT快速現(xiàn)場檢測。首先通過TLC分離出4種不同的黃曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1和AFG2)，然后以金溶膠作為檢測基底，對分離出的斑點進行鑒定，同時通過利用密度泛函理論分析拉曼光譜，確定了4種黃曲霉毒素的顯著振動峰，獲得了4種不同的SERS光譜，并可區(qū)分其特征譜帶。整個過程不需要額外的處理步驟，5 min內(nèi)即可完成。經(jīng)檢測AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的LOD分別為1.5×10-3、1.1×10-2、1.2×10-3、6.0×10-4ng/mL。該方法對AFT具有高選擇性，能夠在霉變復雜樣本中成功識別AFT。

雖然SERS被廣泛用于食品污染物檢測，但SERS仍然存在重復性差、穩(wěn)定性低、儀器成本高、檢測基底局限性等缺點，因此開發(fā)各種靈敏度高、穩(wěn)定性強和再現(xiàn)性好的SERS活性基底是解決該技術(shù)的關(guān)鍵[43]。

2.3.3 電化學生物傳感器

電化學生物傳感器是指利用酶、抗體/抗原、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì)作敏感元件，電極(固體電極、氣敏電極等)作轉(zhuǎn)換元件，以電流或電勢為特征檢測信號的傳感器[44]。根據(jù)敏感元件的不同，電化學生物傳感器可以分為電化學免疫傳感器、電極傳感器、電化學DNA傳感器等[45]。

Yan等[46]開發(fā)了一種新型的電化學發(fā)光生物傳感器，用于超靈敏檢測AFB1。該方法利用滾環(huán)復制技術(shù)制備了一種新型酶驅(qū)動的可編程組裝3D DNA納米花(enzyme-driven programmable assembled 3D DNA nanoflowers，EPDNs)，利用輔助探針和內(nèi)脫氧核糖核酸酶組合的協(xié)同效應(yīng)，有效去除了常規(guī)適配體直接競爭法冗余的雙鏈探針，確保適配體更穩(wěn)定地與靶競爭，大大提高了AFB1的簡單、快速、靈敏檢測。盡管AFB1的含量極低，EPDNs堆積了大量Ru(Ⅱ)配合物[Ru(bpy)32+]，具有優(yōu)異的效率和穩(wěn)定性，仍能產(chǎn)生顯著的電化學發(fā)光信號，其靈敏度得到了大幅度提高。該方法可實現(xiàn)對AFB1的定量檢測，LOD為0.27 ng/L，已成功應(yīng)用于花生和小麥的AFB1分析，回收率為93.7%～106.6%。

Singh等[47]研制了一種基于Mn2O3納米顆粒的電化學免疫傳感器，用于檢測AFB1。Mn2O3納米顆粒具有足夠的結(jié)合位點，可以吸附生物傳感器制造所需的生物分子，包括抗體、蛋白質(zhì)、DNA等。采用共沉積法合成了立方相的Mn2O3，電泳沉積法在氧化銦錫(ITO)表面制備了Mn2O3薄膜，該薄膜用于固定抗體(抗AFB1)，使用差分脈沖伏安法選擇性檢測AFB1。利用牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)來阻斷抗AFB1/Mn2O3/ITO免疫電極表面上未覆蓋的位點，以此避免背景信號干擾。通過加入赭曲霉毒素A和伏馬菌素等其他真菌毒素，發(fā)現(xiàn)BSA/抗AFB1/Mn2O3/ITO免疫電極只對AFB1特異性檢測。通過實際樣品分析發(fā)現(xiàn)該方法在1 pg/mL～10 μg/mL具有良好的線性，免疫電極(BSA/抗AFB1/Mn2O3/ITO)顯示回收率為95%～98.6%。

電化學生物傳感器憑借著高靈敏度、高選擇性、高穩(wěn)定性和易于操作等優(yōu)點，在食品安全[48]、環(huán)境監(jiān)測[49]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但也面臨一些問題，如目前的適配體主要用于識別AFB1、AFB2和AFM1，而其他黃曲霉毒素則沒有適配體[50]。因此在未來，致力于開發(fā)單一生物傳感器同時檢測多種黃曲霉毒素，同時開發(fā)無試劑、無清洗、無校準或無生物污染的電化學生物傳感器就變得至關(guān)重要。

3 結(jié)論

AFT不僅具有高毒性和強致癌性，而且廣泛存在，給食品安全帶來了巨大風險，甚至影響著人類健康發(fā)展。因此，高效精準檢測食品及其他物質(zhì)中的AFT至關(guān)重要。目前，隨著科技進步與發(fā)展，不同檢測技術(shù)在重復性、穩(wěn)定性、靈敏度等方面已經(jīng)有了很大的進步。盡管儀器分析準確度與靈敏度高、重復性好，但存在價格昂貴的問題，并且還需要復雜的樣品前處理過程，不適用于大量樣品分析。免疫試紙條和試紙盒的出現(xiàn)能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場快速檢測大批量樣品，但檢測結(jié)果與真實數(shù)據(jù)具有一定的差距，假陽性和假陰性概率高，嚴重影響檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。TLC操作簡便，但容易受環(huán)境影響，只能實現(xiàn)定性的半定量檢測。SERS的檢測結(jié)果受基底材料限制，有待深入研究。電化學生物傳感器便攜性好、靈敏度高、成本低，已成為當下研究熱點，具有較好的應(yīng)用前景，但目前發(fā)展還尚未成熟。以上方法有各自的優(yōu)點與缺點，需要結(jié)合實際情況選取合適的檢測方法。未來，隨著科技的不斷發(fā)展，AFT的檢測將由實驗室走向現(xiàn)場，由離線分析向原位在線分析轉(zhuǎn)變，并將免疫原理與現(xiàn)代分析技術(shù)相結(jié)合，研究開發(fā)新型食品安全快速檢測技術(shù)，最終實現(xiàn)AFT便攜式一體化高靈敏定量檢測，以及分析方法的多樣化和智能化，共同維護食品安全。