納米羥基磷灰石的制備及在不穩(wěn)定藥物遞送中的應(yīng)用

劉丹，王強(qiáng)，范興君，高俊霞，于鳳波,3

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011；3.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬高州市人民醫(yī)院，廣東 茂名 525299)

1 納米羥基磷灰石

納米藥物載體(粒徑10～1 000 nm)，是一種微觀范疇的藥物載體輸送系統(tǒng)，它的基質(zhì)材料通常是天然或合成的高分子物質(zhì)，通過吸附或者包被作用從而將靶藥物聚集在亞微粒的內(nèi)部或表面，用于實現(xiàn)調(diào)節(jié)藥物進(jìn)入體內(nèi)后的釋放速度、增加膜通透性、提高生物利用度等[1-2]。納米藥物載體一般具有多孔、中空等結(jié)構(gòu)特性，而這些特性使其能夠?qū)λ幬镌隗w內(nèi)緩慢釋放。通過優(yōu)化載體材料的種類和配比，控制藥物的釋放速度，最大程度減少用藥的次數(shù)、劑量，以減輕該藥物的毒副作用[3-4]。納米藥物載體材料主要分為兩大類——無機(jī)類和有機(jī)類，其中無機(jī)類主要包括納米羥基磷灰石和介孔硅基材料，有機(jī)類包括天然及合成高分子材料。

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)，作為人體內(nèi)骨骼和牙齒的主要構(gòu)成成分，不僅無害副作用，而且具有良好的生物相容性。目前，基于HAP的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性，其往往于骨科充當(dāng)藥物植入載體的角色。此外近年來，有研究嘗試將HAP運用于三維打印(three dimensional printing，3DP)技術(shù)領(lǐng)域，將其與聚乳酸基質(zhì)一同作為3DP打印緩釋制劑的材料，凸顯出了較好的市場應(yīng)用前景[5-6]。結(jié)構(gòu)決定功能，功能決定用途，具有多種結(jié)構(gòu)的HAP自然也具有各領(lǐng)域的不同用途，其中人工所合成的高密度HAP主要被用于醫(yī)學(xué)骨修復(fù)以及骨植入領(lǐng)域的支架材料[7]，而具有高效吸附特性的多孔性HAP往往被應(yīng)用于核酸及蛋白質(zhì)等生物大分子的分離及純化實驗。然而，隨著HAP尺寸下降達(dá)到納米級別時，其會呈現(xiàn)出一系列的新的獨特優(yōu)異性能，不僅具有很大的比表面積，表現(xiàn)出較常規(guī)HAP材料更強(qiáng)的藥物吸附與承載能力，并且由于粒徑極小(10～1 000 nm)，其能無障礙的通過癌細(xì)胞的細(xì)胞膜通道，從而進(jìn)入到癌細(xì)胞的內(nèi)部發(fā)揮其生物效應(yīng)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的無限增殖[8]。納米HAP制備方法眾多，并且合成所需的各種原材料也廉價易得，采用不同方法制備所獲得的HAP具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)與功能。

2 納米羥基磷灰石的制備

隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，羥基磷灰石的制備工藝得到了顯著的改進(jìn)，目前制備HAP的方法主要包括干法和濕法[9-10]兩種合成方案。其中，干法合成方法通常能夠獲取到化學(xué)計量和結(jié)晶相對良好的產(chǎn)品，但具有需要相對較高的反應(yīng)溫度以及較長的反應(yīng)時間等缺陷。此外，該方法還必須通過研磨才能進(jìn)一步獲得納米粒子。然而，相較于干法合成方法而言，濕法合成方法所需求的反應(yīng)溫度相對較低也更為容易產(chǎn)生納米顆粒，其不足是該法所制備的產(chǎn)品具有相對較低的結(jié)晶度和Ca/P比率。不同的制備工藝制備的HAP在形態(tài)結(jié)構(gòu)上存在一定差異。

2.1 干法合成 干法合成法(包括固態(tài)合成法和機(jī)械球磨法)，又稱固相反應(yīng)法，是以既定的比例將3種固體原料[Ca(OH)2、Ca3(PO4)2、NaOH]相混合，并分散均勻，通過控制水蒸氣的溫度在1 000 ℃以上，促使一系列反應(yīng)于相界面上得以發(fā)生，從而使固體混合物HAP析出并獲得其粉體。

2.1.1 固態(tài)合成法 固態(tài)合成法[11]是一種利用高溫煅燒的方式以各種研磨后的磷酸鹽為原料來獲得HAP，常用于HAP粉末的合成，這種合成方法的制備工藝相對來說比較簡單，但這種在固態(tài)條件下合成的HAP粉末具有擴(kuò)散系數(shù)較小的特點，以及粒子的組成具有不均勻性。該制備方法于2001年被Tas等[12]首次報道。具體流程為利用粗制的HAP(微米級)為原料，在硫酸鉀(K2SO4)的助熔條件下，多次嘗試改變反應(yīng)過程中的各類條件(包括溫度、時間、反應(yīng)物比例等)，最終于1 080～1 200 ℃得到了呈現(xiàn)出納米晶須結(jié)構(gòu)的HAP。

2.1.2 機(jī)械球磨法 機(jī)械球磨法[13]主要用于合成各種納米陶瓷和塑料合金，通過機(jī)械磨球與塑料磨球之間，磨球與熱塑料罐兩者之間的強(qiáng)力碰撞，使納米粉末材料發(fā)生快速變形、破碎。這些被破碎的粉末在隨后的球磨的過程中又再次發(fā)生冷卻熔焊和融合，再次被球磨破碎，致使晶粒不斷細(xì)化，可以迅速達(dá)到一個納米數(shù)量級。其主要特點在于操作簡單、成本低、重現(xiàn)好，但產(chǎn)品顆粒純度低，顆粒結(jié)構(gòu)分布不均勻。有研究報道[14]，將Ca(NO3)2·4H2O、Na3PO4按Ca/P為1.67比例混合后，于瑪瑙缽中分別研磨5 min、20 min，微波加熱，乙醇和蒸餾水洗滌產(chǎn)物后，烘干得到HAP粉體。結(jié)果表明，該方法成功縮短反應(yīng)時間，降低反應(yīng)溫度，并制備出不同形貌的納米HAP。

2.2 濕法合成

2.2.1 水熱合成法 水熱合成法[15]是指在密閉的高溫、高壓容器中，用少量水或其他水溶液作為熱反應(yīng)催化劑的加熱介質(zhì)，通過溫度及壓力的控制使本來難溶或不溶的固體發(fā)生溶解并出現(xiàn)重結(jié)晶的一種方法(壓力鍋加熱方式：反應(yīng)溫度范圍約100～400 ℃，反應(yīng)的壓力約1～200 MPa)。由該方法制得的HAP粉體，它的晶粒發(fā)育完整，粒度小且分布均勻，容易獲得粉體的化學(xué)反應(yīng)計量物和晶型，但對于反應(yīng)條件、設(shè)備質(zhì)量要求嚴(yán)格，反應(yīng)現(xiàn)象復(fù)雜，肉眼不容易觀察。Lai等[16]采用碳酸鈣(CaCO3)為模板，水熱條件下通過陰離子交換樹脂，在Na2HPO4溶液中成功制備了一種中空的HAP納米球，其粒徑范圍在800～2 000 nm之間。此外，Qi等[17]也利用水熱法得到了一種片狀的HAP，具體方法為：以乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)為螯合劑，尿素為pH調(diào)節(jié)劑，通過調(diào)節(jié)水熱處理溫度和時間，可以很好地控制碳酸化HAP產(chǎn)物的形貌和三維結(jié)構(gòu)。

2.2.2 溶膠-凝膠法 溶膠-凝膠法[18]是指將堿性金屬與乙醇鹽或其他無機(jī)鹽等化學(xué)原料均勻分散在各種有機(jī)溶劑中，而后通過一系列化學(xué)反應(yīng)(高溫水解/醋酸醇解)后生成比較穩(wěn)定而透明的納米溶膠，該溶膠再經(jīng)過高溫陳化后，逐步聚合，進(jìn)而反應(yīng)生成一種具有一定空間結(jié)構(gòu)的納米凝膠，而后經(jīng)過干燥、煅燒等手段去除有機(jī)成分后制備出各種納米化學(xué)粒子或所需材料。該方案的具體流程為：于磷酸鹽溶膠中緩慢滴入鈣鹽，隨后再加入不同量的碳酸氫氨，利用氨水本身的特性調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的酸堿度，其后制得的凝膠經(jīng)陳化、洗滌、干燥、焙燒等工藝最終獲得目標(biāo)產(chǎn)物。該法操作簡便、反應(yīng)溫和，但合成過程耗時較長。

Bakan等[19]利用四水硝酸鈣和磷酸氫二銨為原料，采用溶膠-凝膠法成功制備HAP，為呈六方形的納米針顆粒。黃龍宵等[20]以四水硝酸鈣和五氧化二磷為原料，制備了顆粒狀HAP粉體，將其熱處理后得到一種六方形結(jié)構(gòu)的納米晶體。徐曉虹等[21]利用溶膠-凝膠法制備的HAP，它的結(jié)構(gòu)含碳酸根并且粒徑很小，在40～50 nm之間，同時還發(fā)現(xiàn)在制備過程中用乙醇作為反應(yīng)溶劑時，制得的HAP納米顆粒不僅分散性好，而且仿生性能也提高了。

2.2.3 化學(xué)沉淀法 化學(xué)沉淀法[22]合成HAP是通過把磷酸鹽加入鈣鹽中，控制Ca/P比例為1.67，充分?jǐn)嚢柰瓿煞磻?yīng)后，加入少量堿性溶液(氨水或氫氧化鈉等)調(diào)節(jié)溶液的酸堿度，產(chǎn)生多個羥基磷灰石鹽的沉淀，然后再通過陳化、洗滌、過濾、烘干等多個步驟后，采用400 ℃以上的高溫煅燒獲取干燥HAP，從而制得純凈的HAP晶體。但值得指出的是：該制備方法不僅在制備工藝條件的要求極為嚴(yán)格，同時，由于所制備條件的限制，其所獲得的新型納米HAP顆粒粒徑的均勻性較差，也可能伴隨出現(xiàn)嚴(yán)重的團(tuán)聚擴(kuò)散現(xiàn)象。孫海娜等[23]用化學(xué)沉淀法，以PEG-8000為模板，制備了平均粒徑100 nm的Eu3+摻雜的片狀納米HAP。尹美林等[24]用化學(xué)沉淀法制備了平均粒徑為145 nm的HAP納米晶，具有較好的穩(wěn)定性。

2.2.4 酸堿反應(yīng)法 酸堿反應(yīng)法[13]主要是根據(jù)酸、堿中和反應(yīng)的原理生成HAP。該方法操作簡便，所需設(shè)備簡單，更適合用于工業(yè)化生產(chǎn)，但鑒于其液-固多相反應(yīng)的屬性，易分解成溶膠產(chǎn)物，具有分離相對困難，以及反應(yīng)時間較長等不足。

2.2.5 水解法 水解法[25]是一種綜合反應(yīng)法，先制備固體前驅(qū)體CaHPO4，隨后設(shè)定相應(yīng)的水解條件(溫度70 ℃)以及酸堿度(pH=8.5)以達(dá)到在晶格中加入氫氧根離子的目的，從而得到不同形貌的納米顆粒。此方法的基本原理是利用水解反應(yīng)(固體氣相液體表面與未溶解的離子)，具有可控性好的優(yōu)點。Wang等[26]以CaHPO4為原料，在75℃水解制備了粒徑范圍為13.7～23.1 nm的HAP納米粉體。

2.2.6 微乳液法 微乳液法[27]是指以含鈣和磷酸鹽為原料的反應(yīng)體系中添加表面活性劑(增加反應(yīng)體系的分散性)，利用水和有機(jī)助溶劑的相互作用而形成乳液，進(jìn)而沉淀析出羥基磷灰石。該方法具有工藝簡單，粒徑可控(一般分布在10～100 nm)等優(yōu)勢，但該方法收率較低，需要使用大量的有機(jī)溶劑，一方面具有較大風(fēng)險會對人體和環(huán)境造成危害，另一方面是其制作成本較其他方法更高。Bose等[28]以表面活性劑為模板，環(huán)己烷為油相，硝酸鈣和磷酸為水相合成了HAP粉末，其粒徑為30～50 nm，結(jié)構(gòu)形貌呈針狀和球形。

2.2.7 模板法 模板法[29]是基于某種具有特征結(jié)構(gòu)的物質(zhì)為模板，于特定實驗條件下，計算得到包含模板結(jié)構(gòu)的目標(biāo)物的方法。例如，利用表面活性劑吸附鈣離子和磷酸根離子并進(jìn)而形成膠束。用該方法所制得HAP結(jié)晶粉末不僅其形貌可控，而且具有諸多優(yōu)點，顆粒分散性高而團(tuán)聚現(xiàn)象比較輕微。張愛娟等[30]以中空的CaCO3為模板獲得了中空HAP微球。但受限于Ca2CO3模板的大小，大規(guī)模的運用該方法生產(chǎn)HAP微球是極其困難的。

3 納米羥基磷灰石在不穩(wěn)定藥物遞送中的應(yīng)用

目前，以RNA為代表的基因藥物具有新藥開發(fā)周期短、序列特異性高、體內(nèi)具有內(nèi)源性、毒副作用小等諸多優(yōu)點。在歷經(jīng)二十幾年的研發(fā)后，美國三大RNA研發(fā)公司BioNTech、Moderna Therapeutics和CureVac AG在多家全球醫(yī)藥巨頭的支持下，近年來研發(fā)的腫瘤、傳染病、心血管等多種疾病的RNA疫苗，紛紛進(jìn)入臨床試驗及實際應(yīng)用當(dāng)中。由于此類藥物在體內(nèi)極易被核酶發(fā)現(xiàn)降解且細(xì)胞透過率低，很難到達(dá)細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效，因此，將其遞送至細(xì)胞內(nèi)的載體技術(shù)至關(guān)重要。近年來，納米HAP及其復(fù)合材料作為抗生素類藥物[31-32]、蛋白質(zhì)與核酸等基因藥物[33-38]緩控釋載體材料已有諸多報道。

3.1 納米羥基磷灰石在抗生素中的應(yīng)用 Lai等[16]以多孔中空羥基磷灰石微球為載體，鹽酸阿霉素(DOX)作為模型藥物，探索了其在載藥量和藥物控釋方面的潛在應(yīng)用。結(jié)果顯示，制備的聚羥基磷灰石微球在負(fù)載DOX時表現(xiàn)出高的載藥量和對酸堿度敏感的緩、控釋行為。Ait Said等[32]采用固-液混合法，以羥基磷灰石(HAP)、殼聚糖(CS)、環(huán)丙沙星(CIP)為原料，通過優(yōu)化固-液比和少量殼聚糖的使用，制備了羥基磷灰石和殼聚糖聚合物負(fù)載環(huán)丙沙星抗生素的復(fù)合材料。其體外釋放試驗表明，該局部負(fù)載抗生素的代骨材料在菲式擴(kuò)散機(jī)制下，能保證載荷劑量(0.2～2.5 mg·d-1)持續(xù)10 d。

3.2 納米羥基磷灰石在蛋白質(zhì)分離和純化中的應(yīng)用 Esfahani等[33]通過化學(xué)沉淀法以3種不同的成分制備了帶正電的含鋅羥基磷灰石(x-ZH)納米顆粒，在靜電紡絲尼龍-6納米纖維(NFs)上創(chuàng)建了一個帶正電的表面，即牛血清白蛋白(BSA)，以改善帶負(fù)電蛋白質(zhì)吸附的分離和選擇性。研究結(jié)果表明，x-ZH納米粒子在尼龍纖維中分布良好，具有足夠的拉伸強(qiáng)度(4.15～5.70 MPa)，在對BSA進(jìn)行吸附時，摻鋅羥基磷灰石的靜電紡絲尼龍膜(N-4ZH：4表示鈣位點被鋅陽離子所占據(jù)，即N-xZH膜中鋅含量)對蛋白的吸附時間較長。N-4ZH膜能在1 h內(nèi)分離250 mg·cm-3BSA分子，表明該膜具有捕獲蛋白質(zhì)的潛力。此外，已有研究團(tuán)隊[34]利用合成的納米HAP作為載體(以牛血清白蛋白(BSA)作為將負(fù)載的藥物)，測定不同條件下HAP的吸附量及其負(fù)載藥物的釋放度。相應(yīng)的研究數(shù)據(jù)表明，HAP納米顆粒能夠勝任該類緩釋藥物的載體角色。

3.3 納米羥基磷灰石在核酸中的應(yīng)用 研究表明[35]磷酸鈣(CaP)基因載體(如HAP)可以克服內(nèi)體逃逸、酶降解和核吸收的障礙，它不需要使用額外的化合物來破壞核內(nèi)體。HAP是牙齒和骨骼的主要成分，因此具有高度的生物相容性，不會引發(fā)免疫原性或炎癥反應(yīng)。有報道稱，Ca2+與帶負(fù)電荷的基因分子(如DNA和RNA)之間的靜電相互作用提高了攜帶基因的穩(wěn)定性，這可以保護(hù)基因不受細(xì)胞質(zhì)和核降解的影響。Ca2+濃度的增加通過滲透失衡和基因載體分離促進(jìn)內(nèi)體破裂，這是發(fā)生核酸進(jìn)入之前所必需的。高可雷等[36]早期研究結(jié)果也顯示攜有NT-3基因的納米HAP顆粒，不僅可轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的小鼠耳蝸神經(jīng)元中，亦能轉(zhuǎn)染到活體豚鼠的耳蝸神經(jīng)元內(nèi)。

Liang等[37]利用羥基磷灰石納米顆粒(HAP)提供的基于質(zhì)粒的Stat3特異性短發(fā)夾RNA(sh-Stat3)，研究了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(Stat3)干擾對體外培養(yǎng)的RM1前列腺癌細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明，通過促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，HAP遞送的sh-Stat3顯著降低RM1細(xì)胞的活力。Balagangadharan等[38]制備出載miR-590-5p的殼聚糖/納米羥基磷灰石/納米二氧化鋯骨再生支架，利用小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(C3H10T1/2)，在細(xì)胞和分子水平上檢測生物活性分子(miR-590-5p)對支架的成骨細(xì)胞分化的影響。結(jié)果顯示CS/nHAP/nZrO2支架促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，在C3H10T1/2細(xì)胞中miR-590-5p的存在進(jìn)一步增強(qiáng)了這種作用。

4 展望

作為可在人體內(nèi)應(yīng)用的藥物遞送載體，需要具備良好的生物相容性和可降解性，良好的理化和生物穩(wěn)定性，極低的毒性，以及更高的藥物負(fù)載能力。HAP的組成與人類骨骼和牙齒大致相同，與其他微生物具有良好的相容性，并且能夠于機(jī)體內(nèi)代謝降解后通過消化道隨著糞便一同排出體外，因此，其對于機(jī)體來說也具備較高的安全性；不同形狀的納米HAP具有極高的比表面積以及載藥空隙，因此在納米級制劑載體中，藥物負(fù)載能力較強(qiáng)，這也是納米HAP被選作藥物遞送系統(tǒng)的必要條件。由目前的文獻(xiàn)報道來看，納米HAP及其復(fù)合物是一種具備高載藥能力，高保護(hù)能力和高轉(zhuǎn)染性能的無機(jī)納米材料。因此，其在未來基因藥物及抗腫瘤藥物的體內(nèi)遞送方面極具發(fā)展?jié)撃堋?/p>