脂肪源性間充質(zhì)干細胞治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究進展*

趙 娟， 舒 晴， 田 峻△

1武漢體育學(xué)院健康科學(xué)學(xué)院，武漢 430079 2武漢大學(xué)中南醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，武漢 430071

最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發(fā)病率呈明顯上升趨勢，在美國估計有1000萬50歲人群患有髖關(guān)節(jié)骨質(zhì)疏松癥，每年約有150萬例骨質(zhì)疏松性骨折[1]。在歐洲，估計有2760萬人患有年齡相關(guān)性骨質(zhì)疏松癥，其中350萬人發(fā)生了骨折[2]。我國50歲以上女性PMOP發(fā)病率高達32.1%，顯著高于全球平均水平[3]，嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量。PMOP主要表現(xiàn)為骨量流失、骨質(zhì)脆性增加，骨折風(fēng)險增加[4]。臨床上對于PMOP的發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認(rèn)為可能是由于各種原因造成了成骨細胞與破骨細胞的關(guān)系失衡[5]。臨床上對于PMOP的治療以藥物為主，雖然有一定效果，但也存在不可避免的副作用[6]。PMOP的治療藥物主要包括骨吸收抑制劑(如二磷酸鹽類、雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、骨形成促進劑(如甲狀旁腺激素)、骨礦化物(鈣劑和維生素D)[7]。但長期使用雌激素受體調(diào)節(jié)劑會增加乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險，骨礦化物只能起到補充骨基質(zhì)的作用，僅能作為輔助治療[8]。因此，為了尋找更加理想的治療手段，研究者把目光投向了間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。

1 MSCs概述

MSCs是一類存在于骨髓、臍帶血、脂肪、肝臟等組織中且具有多向分化潛能的原始細胞，有著極強的自我增殖和更新能力[9]。根據(jù)MSCs來源不同，可分為骨髓源性間充質(zhì)干細胞(BMSCs)、脂肪源性間充質(zhì)干細胞(ADSCs)、骨骼肌源性間充質(zhì)干細胞(MDSCs)、滑膜源性間充質(zhì)干細胞(SMSCs)等[10]。研究表明，來源于人機體不同部位的MSCs其表面分子標(biāo)記不同，BMSCs高表達CD271，而ADSCs則高表達CD10、CD13、CD49d、CD29等[11-12]。近年來，干細胞療法作為當(dāng)前醫(yī)療領(lǐng)域的熱點，因干細胞的多向分化潛能引起了廣泛的關(guān)注和研究，并開展了越來越多的臨床研究[13]。

2 MSCs在PMOP中的應(yīng)用

現(xiàn)有研究表明，MSCs可以分化成為脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞等多種組織細胞[14]。因此，MSCs移植有望成為PMOP治療的新策略和新方法。

2.1 現(xiàn)有MSCs治療PMOP的優(yōu)勢與不足

目前應(yīng)用于PMOP防治研究的干細胞主要有BMSCs、MDSCs、ADSCs等，而BMSCs在防治PMOP中應(yīng)用是最多的[15]。PMOP的發(fā)生與機體內(nèi)MSCs的成骨分化能力降低有關(guān)，而大量實驗研究證明，MSCs的成骨分化能力使其具備治療骨質(zhì)疏松癥的強大潛力[16]。同時，PMOP還與機體內(nèi)MSCs的數(shù)量下降有關(guān)[17]。BMSCs移植療法，從根源上補充了PMOP患者體內(nèi)與成骨有關(guān)的原始細胞，解決了原始細胞不足問題[18]。因此，BMSCs移植可以有效避免藥物治療的毒副作用，是一種較為綠色的治療手段。

但是BMSCs療法也存在諸多不足之處。BMSCs雖然在體外分化較為迅速，但PMOP患者體內(nèi)BMSCs的成骨分化潛力仍然不足[19]；另外，由于骨髓在人體含量相對較少，而BMSCs在骨髓當(dāng)中又很少見，因此要獲得足夠數(shù)量原代培養(yǎng)的BMSCs比較困難；而且獲取BMSCs需要反復(fù)抽吸骨髓導(dǎo)致患者接受度不高，這些都是目前限制其臨床應(yīng)用的重要原因[20]?？梢夿MSCs的臨床應(yīng)用仍存在較大局限性。因此，就需要尋找一種更為理想的MSCs。

2.2 ADSCs治療PMOP的優(yōu)勢

ADSCs存在于脂肪組織中，大量實驗研究證明了ADSCs在成骨分化、自我更新、快速增殖等方面的潛力及改善PMOP的有效性[21]。另外，在骨質(zhì)疏松動物模型中提取的ADSCs具有和健康動物相似的成骨分化潛能[22]；人源ADSCs相比BMSCs受到年齡和多代傳代的影響也更小[23]，為骨質(zhì)疏松癥患者進行自體ADSCs移植提供了可能。另外，在成骨微環(huán)境中，ADSCs不受雌激素缺乏的影響仍可以促進骨組織的形成，為因雌激素缺乏而導(dǎo)致的PMOP治療提供了希望[24]。還有研究表明ADSCs表達的趨化因子CXCL12是BMSCs的3倍，進而能更好地促進小鼠造血干細胞歸巢到骨髓[25]。以上研究說明，ADSCs在干細胞療法治療骨質(zhì)疏松上具有很強的潛力，甚至可能比BMSCs更有優(yōu)勢。

3 ADSCs治療PMOP的有效性

ADSCs從首次被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，許多學(xué)者都相繼用實驗證明了其成骨分化、自我更新、快速增殖等方面的潛力及對于PMOP治療的有效性[26]，這為ADSCs的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

3.1 ADSCs體外成骨分化證據(jù)

研究人員從棕熊的體內(nèi)提取出ADSCs并進行體外單層培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沒有特定誘導(dǎo)劑的情況下ADSCs也能在體外自發(fā)進行成骨分化[27]。此外，從去勢骨質(zhì)疏松動物模型皮下脂肪組織中獲取的ADSCs，經(jīng)過體外培養(yǎng)，其成骨分化潛能與健康動物相似[22]。由此可見，ADSCs在體外有良好的成骨分化能力。

3.2 ADSCs體內(nèi)移植治療PMOP的實驗研究

大量動物實驗證明，ADSCs無論通過局部移植還是系統(tǒng)移植均能有效地增加骨密度，改善PMOP。研究表明，在去勢骨質(zhì)疏松大鼠股骨近端植入自體ADSCs，可促進骨再生，增加骨強度[28]。同時，從去勢兔股骨遠端植入自體ADSCs，其成骨細胞分化能力顯著增強，新骨形成明顯增多，骨密度增加[29]。Mirsaidi等[30]的研究也發(fā)現(xiàn)自體ADSCs脛內(nèi)移植可使骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁數(shù)量增加，骨密度顯著升高。由此可見，局部自體移植ADSCs能改善骨的微細結(jié)構(gòu)，增加成骨能力，從而改善PMOP。

另外，ADSCs的系統(tǒng)移植也被應(yīng)用于治療PMOP。研究發(fā)現(xiàn)，通過尾靜脈注射將ADSCs移植到去勢骨質(zhì)疏松模型大鼠體內(nèi)，骨礦鹽含量提高，骨形態(tài)改善，骨密度增加[31]。因此，全身ADSCs移植后能夠改善去勢骨質(zhì)疏松大鼠的骨量流失，對骨質(zhì)疏松具有預(yù)防作用[32]。同時，經(jīng)尾靜脈注射ADSCs可以有效促進去勢大鼠的骨形成，抑制破骨細胞活性，改善骨質(zhì)疏松病理結(jié)構(gòu)，對去勢大鼠骨質(zhì)疏松具有一定的治療作用[33]。另外，將ADSCs系統(tǒng)移植到去勢小鼠體內(nèi)可發(fā)現(xiàn)ADSCs能分泌多種骨細胞激活因子，包括干細胞生長因子和細胞外基質(zhì)因子，從而防止骨丟失[34]。這些研究支持ADSCs作為一種基于自體細胞的方法來治療PMOP[35]。

4 ADSCs成骨分化的調(diào)控通路及分子機制

目前為止，ADSCs成骨分化的分子機制尚未完全闡明。許多學(xué)者經(jīng)過探索，提出了一些可能的通路機制。

4.1 MAPK/PI3K-Akt信號通路

研究表明，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、PI3K-Akt信號通路可能參與了ADSCs的成骨分化調(diào)控[36]。在去卵巢大鼠體內(nèi)自體ADSCs移植，用MAPK/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2抑制劑或PKA抑制劑作用于ADSCs，可顯著抑制成骨標(biāo)志物的表達，這表明ADSCs成骨的誘導(dǎo)依賴于ERK和PKA信號通路[37]。另有研究表明，ADSCs條件培養(yǎng)液通過Smad蛋白/ERK/JNK(c-junnh2末端激酶)的激活促進成骨細胞的增殖和分化，通過ERK/JNK/p38的激活促進破骨細胞的存活和分化，ADSCs分泌的旁分泌因子可以改善骨修復(fù)[34]。由此可見，MAPK信號通路可能是PMOP的候選通路機制。

同時，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄共激活因子TAZ是促進ADSCs發(fā)揮成骨細胞譜系作用的關(guān)鍵介質(zhì)，在ADSCs中激活TAZ可能成為一種可行的促進骨再生和修復(fù)的方法[38]。且TAZ可以通過PI3K/Akt信號通路促進骨質(zhì)疏松大鼠MSCs的成骨分化[39]。研究表明，ADSCs中RhoA活性蛋白和巖石底物分子p-MYPT1的高表達可促進其成骨分化，而RhoA抑制劑可抑制TAZ激活，從而抑制ADSCs增殖和成骨分化。而siRNA轉(zhuǎn)染敲除TAZ后，顯著抑制了ADSCs的增殖和成骨分化。由此可見，RhoA活性蛋白表達不受TAZ特異性siRNA轉(zhuǎn)染的影響，提示RhoA位于TAZ的上游。綜上所述，RhoA-TAZ信號通路的激活可促進ADSCs的增殖和成骨分化[40]。

4.2 TGF-β/BMP-2信號通路

研究表明，成骨誘導(dǎo)ADSCs的機制可能是通過激活BMP-2/BMP受體ⅠB型信號通路，促進ADSCs的成骨和抑制脂肪生成的[41]。

另外，microRNA也參與了BMP-2的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾(RNAi)下調(diào)基因內(nèi)BMP-2的表達，能抑制骨生成和增加脂肪生成，而miR-17-5p和miR-106a上調(diào)也可達到同樣的效果。miR-17-5p和miR-106a促進ADSCs成骨和抑制其成脂的作用可被BMP-2 RNA干擾逆轉(zhuǎn)。因此，miR-17-5p和miR-106a通過直接靶向BMP-2調(diào)控ADSCs的成骨和成脂，從而降低成骨TAZ、MSX2和Runx2，增加成脂C/EBPα和PPARγ[42]。由此可見，BMP-2可能是miR-17-5p和miR-106a的直接靶點。因此，BMP-2可能是PMOP成骨分化的潛在通路機制。

4.3 Wnt信號通路

研究發(fā)現(xiàn)，PTH1-34可以磷酸化SIK2，上調(diào)RANKL，下調(diào)SOST，從而上調(diào)Wnt4，促進ADSCs的成骨過程。雖shRNA干擾Wnt4表達對上游蛋白RANKL、SOST的表達影響不大，但會影響其他下游成骨蛋白Runx2、Osterix、骨鈣素的表達，進而抑制ADSCs的成骨過程[43]。此外，rhRunx2修飾的ADSCs基因治療促進了骨質(zhì)疏松的下頜骨新骨形成，能有效彌補系統(tǒng)性骨質(zhì)疏松對新骨形成的不利影響[44]。因此，ADSCs的成骨應(yīng)考慮到Wnt信號通路的調(diào)控作用。

4.4 miRNA參與ADSCs成骨分化的機制

miR-429在PMOP患者血清中表達明顯上調(diào)。在成骨分化過程中，過表達miR-429可顯著降低ALP活性。同時，miR-429可以與SCD-1結(jié)合并負調(diào)控其在ADSCs中的蛋白水平，使SCD-1在ADSCs成骨分化過程中明顯下調(diào)。此外，沉默SCD-1可抑制成骨相關(guān)基因表達、ALP活性和鈣化能力。且miR-429通過下調(diào)SCD-1抑制ADSCs的成骨分化[45]。因此，miR-429可能是ADSCs成骨的潛在靶點。circFOXP1在PMOP患者骨組織中明顯下調(diào)，但circFOXP1結(jié)合miR-33a-5p通過靶向FOXP1促進ADSCs成骨分化。因此，circFOXP7ay可通過促進ADSCs成骨分化來預(yù)防PMOP，可作為PMOP患者體內(nèi)ADSCs成骨的候選治療靶點[46]。另外，研究表明下調(diào)miR-10b可以通過調(diào)控CEBPα表達水平促進小鼠ADSCs的成骨分化進程。因此，miR-10b作為成骨分化的負向調(diào)節(jié)因子可能成為PMOP潛在的干預(yù)靶點[47]。

4.5 其他信號通路

研究發(fā)現(xiàn)，Nell-1處理能增加Hedgehog信號通路表達，從而促進ADSCs成骨分化。這表明，Hedgehog和Nell-1信號通路可能是ADSCs成骨分化的可能信號通路[48]。

另外，對ADSCs中鋅脂蛋白467(Zfp467)的RNA干擾抑制了脂肪細胞的形成，并刺激了成骨細胞的形成。si-Zfp467可調(diào)控ADSCs中成骨和成脂標(biāo)志物mRNA水平。在去勢骨質(zhì)疏松小鼠模型中，ADSCs中的Zfp467 RNAi可以恢復(fù)骨功能和結(jié)構(gòu)。由此可見，Zfp467是ADSCs向脂肪細胞和成骨細胞分化的可能作用靶點[49]。

C5AR1的表達水平在ADSCs成骨分化過程中顯著升高。C5AR1的下調(diào)顯著降低了成骨分化標(biāo)志物的表達水平和鈣結(jié)節(jié)形成能力。C5AR1可能是ADSCs成骨分化所必需的新基因和途徑，操縱這個候選基因的水平可能有助于PMOP的治療[36]。

5 ADSCs成骨分化的影響因素

迄今為止，有很多研究證據(jù)表明，ADSCs成骨分化受多種因素調(diào)控。合理地利用這些誘導(dǎo)因素，深入探討ADSCs成骨分化的精確調(diào)控機制，可為ADSCs防治PMOP提供更可靠的證據(jù)。

5.1 激素

某些激素的水平可以影響ADSCs的分化能力，如甲狀旁腺激素能在ADSCs成骨方面發(fā)揮作用，其可能是通過調(diào)節(jié)SIK2和Wnt4影響ADSCs的成骨過程[43]。且與其他MSCs不同的是，ADSCs不受雌激素缺乏的影響，具有更好的成骨優(yōu)勢[24]。

5.2 藥物

在去勢骨質(zhì)疏松大鼠模型中，阿司匹林可抑制血清中腫瘤壞死因子和干擾素-γ等促炎細胞因子水平，其抗炎能力與骨形態(tài)計量學(xué)呈正相關(guān)。由于阿司匹林在體外具有良好的趨化作用，并可在體內(nèi)早期加速同種異體ADSCs的歸巢進入骨髓，因此，阿司匹林聯(lián)合異基因ADSCs能部分逆轉(zhuǎn)去勢PMOP大鼠骨丟失[50]。阿司匹林促進ADSCs的增殖和成骨分化的機制，可能是通過Wnt及TGF-β信號通路來實現(xiàn)的[51]。

同時，許多中藥或中藥成分也能促進ADSCs成骨分化能力，其中左歸丸和右歸丸均可上調(diào)成骨誘導(dǎo)后ADSCs中β-catenin、Lef-1及Wnt3a蛋白，由于右歸丸可顯著提高ADSCs成骨分化早期的ALP表達量，可明顯促進成骨細胞的成熟及礦化，作用效果更為顯著[52-53]。同時，葛根素也在ADSCs成骨分化過程中有積極影響，去勢骨質(zhì)疏松大鼠ADSCs成骨分化能力與加入含葛根素培養(yǎng)液的時間和培養(yǎng)液中葛根素的濃度呈正相關(guān)，濃度為12 mmol/L時呈現(xiàn)無毒劑量下促進成骨分化的作用最顯著[54]。另外，中藥骨康含藥血清培養(yǎng)脂肪干細胞移植可促進骨質(zhì)疏松性骨折愈合[55]，其可能是通過促進CBFA1和OCN的表達實現(xiàn)的[56]。有研究表明，特定條件下大豆苷類似物能使BMSCs和ADSCs關(guān)鍵成骨基因(RUNX2、c-FOS、SPARC、DLX5、SPP1、COL1A1、IGF1、SOST和DMP1)表達增加，提前誘導(dǎo)這些譜系特異性基因能通過大豆苷類似物激活不同的雌激素受體(ER)和非雌激素受體(non-ER)途徑來誘導(dǎo)BMSCs和ADSCs的分化[57]。且柚皮苷對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ADSCs成骨分化的抑制具有保護作用，其作用可能與Wnt信號通路有關(guān)[58]。

5.3 年齡

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，衰老能降低ADSCs成骨分化效率和潛能[59]。盡管年齡對間充質(zhì)細胞的成骨分化能力有影響，但有學(xué)者將去勢骨質(zhì)疏松模型大鼠ADSCs與正常老齡大鼠的ADSCs進行對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其成骨向分化能力無明顯差別[60]。老齡骨質(zhì)疏松大鼠的ADSCs也可以考慮作為種子細胞促進其自體骨愈合。

5.4 其他因素

研究發(fā)現(xiàn)，低頻脈沖電磁場可在早期刺激ADSCs的細胞增殖，隨后促進骨相關(guān)基因表達和誘導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達以刺激成骨分化[61]。同時，向正宗等[62]認(rèn)為電磁場可以誘導(dǎo)ADSCs成骨分化。由此可見，電磁場等物理療法也可以促進ADSCs的成骨分化能力。

且有大量研究表明，針灸能對骨質(zhì)疏松的成骨通路進行調(diào)控如Wnt/β-catenin、TGF-β/BMP-2等[63]。同時可以使PMOP患者體內(nèi)骨形態(tài)生發(fā)蛋白2的含量和功能增強，從而誘導(dǎo)成骨分化與增殖[64]。有學(xué)者還發(fā)現(xiàn)電針可以通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響骨代謝[65]。據(jù)此，我們推測針灸也可能是一種調(diào)控ADSCs成骨分化的潛在有效手段。

6 ADSCs治療PMOP的臨床應(yīng)用潛力

研究者通過對30名女性骨質(zhì)疏松患者ADSCs進行研究，發(fā)現(xiàn)人類ADSCs也能進行成骨分化[45]。有學(xué)者分別從年輕和老年P(guān)MOP患者的體內(nèi)提取出ADSCs進行研究，結(jié)果表明兩者的ADSCs都可發(fā)生成骨分化和增殖[23]。同時，將PMOP患者的ADSCs放入條件培養(yǎng)液后，成骨潛能顯著提高[30]。由此可見，人來源的ADSCs具有一定的成骨潛能，而且PMOP患者的ADSCs也同樣具有成骨能力，也可考慮作為移植的細胞來源。

7 總結(jié)與展望

綜上所述，ADSCs在改善骨質(zhì)疏松方面具有廣泛的應(yīng)用前景。由于ADSCs移植治療PMOP的諸多優(yōu)勢，在組織工程技術(shù)成熟的基礎(chǔ)上，ADSCs移植治療PMOP將很可能廣泛應(yīng)用于臨床實踐，為骨質(zhì)疏松患者帶來福音。如今，應(yīng)用ADSCs移植治療PMOP仍然存在許多問題,如：調(diào)控機制通路仍未完全闡明，無法進行精準(zhǔn)控制其分化方向；注射用量及注射途徑尚無統(tǒng)一共識；合適的細胞培養(yǎng)代數(shù)選擇及移植后細胞遷移與歸巢問題等。這些問題仍然需要我們進一步研究和討論,ADSCs真正應(yīng)用于PMOP患者還有很長的路要走。