基于多肽藥物研究探索性實驗的本科教學模式探討*

蔣 能，黃書桐，鐘國琿，蘇 弟，龍娟月，顏志明

(1 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院藥學部，廣西 南寧 530021；2 廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西 南寧 530021)

廣西醫(yī)科大學藥學教育歷史悠久、藥學學科種類齊全、是廣西醫(yī)藥最高學府，肩負著培養(yǎng)創(chuàng)新性高素質(zhì)藥學專業(yè)技術(shù)人才。為了適應(yīng)藥學教學新的發(fā)展，如何引導學生學習生物藥物方面的知識是藥學本科教育的新趨勢。隨著生物技術(shù)的突破和發(fā)展，疾病的預防、診斷和治療取得革命性的進展。從小分子藥物到生物藥物的發(fā)展，Lilly公司于1982年將第一個重組蛋白質(zhì)藥物胰島素投放市場，標志著生物藥物向臨床應(yīng)用取得成功[1]。在隨后的幾十年中，多肽藥物、蛋白藥物、單克隆抗體及疫苗等猶如雨后春筍，對醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有引領(lǐng)作用。多肽是由多個氨基酸通過肽鍵形成的一系列化合物，普遍存在于生物體內(nèi)。在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的多肽達數(shù)萬種，廣泛參與調(diào)節(jié)細胞、組織、器官和系統(tǒng)的生命活動。多肽藥物主要來源于人體內(nèi)源性多肽(GLP-1、酪酪肽(PYY)、胃泌酸調(diào)節(jié)素(OXM)等)或者天然多肽(如苦瓜多肽、蛇毒、唾液酸、蜂毒等)，集合了傳統(tǒng)化學藥物和蛋白質(zhì)藥物的優(yōu)點，天然來源的多肽是對小分子類天然活性成分的重要補充。多肽的成藥性一般高于小分子，具有活性高、特異性強、毒性低、體內(nèi)不易蓄積及藥物相互作用小等特點。缺點是多肽的穩(wěn)定性較差，一般難以直接成藥。在這樣背景下，教學和科研相互促進已成為新型教學體系的特征之一[2-3]，結(jié)合具體的多肽藥物長效化探索性實驗，加強對藥學本科生對此類知識的傳授的同時，對相關(guān)教學模式探討。

1 糖尿病GLP-1受體激動劑長效化研究背景的文獻調(diào)研教學

前面提到多肽藥物具有活性強、毒性低和在體內(nèi)不容易蓄積等優(yōu)點。但是存在穩(wěn)定性差和半衰期短等方面的缺點。在這個基礎(chǔ)上引導學生進行思考如下問題，GLP-1受體激動劑在糖尿病治療方面的背景，如何延長該類多肽藥物的半衰期。帶著上述問題，引導學生進行文獻的歸納和總結(jié)。

全球有4億多人患有2型糖尿病(T2DM)，約占全世界糖尿病病例的90%[1-3]。令人擔憂的是，在過去的30年里，全球2型糖尿病的患病率翻了一番。T2DM是一種病理復雜且治療昂貴的疾病，它會導致心血管疾病、失明、腎功能衰竭、下肢截肢和其他一些長期并發(fā)癥，嚴重降低患者的生活質(zhì)量。由于T2DM及其并發(fā)癥，大多數(shù)患者最終需要多種藥物治療，這促進了新藥的開發(fā)。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)具有激活GLP-1受體、刺激胰腺細胞分泌胰島素、增強食欲抑制和減肥等多種生物學活性，是2型糖尿病的一個很有前景的藥理靶點，由于二肽基肽酶IV(DPP-IV)能快速降解天然GLP-1的兩個N端氨基酸，半衰期很短。研究人員致力于利用多種方法延長GLP-1的半衰期[4-5]。

促進靶肽與人血清白蛋白(HSA)的物理相互作用已被證明是延長GLP-1半衰期的有效途徑。脂肪酸可以與白蛋白結(jié)合，具有很高的白蛋白親和力。因此，肽脂質(zhì)化可通過促進白蛋白相互作用來改善肽類藥物的藥代動力學。這種方法已成功地用于開發(fā)利司那肽和索馬魯肽，這是因為藥物與HSA的親和力而抑制了蛋白水解降解，降低了腎臟清除率。然而，脂類可導致溶解度急劇降低，且通常不適用于肽。因此，通過增強溶解度、HSA親和力或其他治療特性來調(diào)節(jié)血清白蛋白相互作用的替代策略仍然具有吸引力[6-7]。本文中，我們探索了一種新的小分子白蛋白粘合劑與肽結(jié)合的替代方法。

一些陰離子芳香族小分子具有很高的白蛋白結(jié)合親和力，可以作為一種替代油脂。麥可酚酸(MPA)具有很高的白蛋白結(jié)合親和力，可以廣泛地與HSA結(jié)合(97%～98%)。在我們之前的研究中，我們已經(jīng)證明，與利拉魯肽相比，MPA白蛋白結(jié)合物修飾的爪蟾GLP-1類似物在db/db小鼠中具有更長的降糖活性[8]。在自然界中，多價結(jié)合策略經(jīng)常用于增強弱配體-受體相互作用，二聚體配體的親和力可顯著高于其固有成分的親和力之和[9]。因此，我們假設(shè)具有兩個MPA部分的小分子白蛋白粘合劑(DiMPA)可作為進一步改善肽藥物半衰期的有效方法。

2 糖尿病GLP-1受體激動劑長效化設(shè)計方法的教學

多肽的長效化結(jié)構(gòu)修飾是多肽藥物研究的重要組成部分，在該探索性實驗的教學實踐中還設(shè)計到藥物的設(shè)計方法、體內(nèi)外活性評價及藥物代謝動力學等方面的研究。藥學本科生參與課題研究，能夠更加直觀和深刻理解這些概念在藥物研究中的應(yīng)用。接下來介紹發(fā)表在RSC Advance雜志上的成果(Discovery of lixisenatide analogues as long-acting hypoglycemic agents using novel peptide half-life extension technology based on mycophenolic acid, RSC Advances, 2020, 10, 12089-12104)，藥學本科生參與的課題研究[10]。

利司那肽是一種基于exendin-4的潛在GLP-1受體激動劑，在體內(nèi)半衰期為3～4 h，臨床給藥每天一次。我們選擇利司那肽作為模型肽，并對DiMPA修飾的利司那肽類似物進行了一系列原理驗證研究。首先，為了避免嚴重的生物活性喪失和確定利司那肽合適修飾的位點，將三種烷基鏈長度不同的MPA白蛋白鍵與利司那肽的三種賴氨酸殘基(Lys12、Lys27和Lys39)進行了位點特異性連接。利用這一策略，我們在Lys12、Lys27和Lys39制備了9種不同的MPA修飾的利司那肽類似物，并探討了它們的體外GLP-1受體激活效力、穩(wěn)定性和體內(nèi)降血糖活性。選擇了體外受體激活效價高、血漿穩(wěn)定性好、體內(nèi)降血糖活性好的化合物1f進行下一步的DiMPA修飾。

接下來，利用賴氨酸上的兩個氨基，我們設(shè)計了一個帶有十一碳烷基鏈的DiMPA白蛋白配體，并與的Lys27連接，制成2a。考慮到DiMPA修飾可能帶來溶解度問題以及間隔基的重要性，在DiMPA白蛋白結(jié)合配體和利司那肽之間引入不同長度的8-氨基-3，6-二氧辛酸(OEG)間隔物，得到2b-2d。MPA是一種肌苷單磷酸脫氫酶(IMPDH)的抑制劑，已被用作免疫抑制劑。我們假設(shè)MPA與利司那肽等肽類激素結(jié)合不會產(chǎn)生免疫抑制作用。霉酚酸酯是MPA的前藥，通常每天給藥數(shù)千毫克，生物利用度約為90%，它的藥理相關(guān)劑量遠遠超過利司那肽(利司那肽的推薦劑量為10～20 mg/天)。

在本研究中，我們研究了DiMPA白蛋白粘合劑作為一種新的方法來改善肽的藥代動力學。為此，我們使用短效GLP-1受體激動劑利司那肽和DiMPA白蛋白配體修飾的位點特異性進行了原理驗證研究。此外，還對利西那肽類似物的理化性質(zhì)、穩(wěn)定性、抗糖尿病和促胰島素特性、毒性和長期治療效果進行了廣泛的研究。

3 結(jié) 語

通過“利司那肽長效化修飾”課題的實施，促進藥學本科生對多肽藥物研究理論知識及相關(guān)概念的理解和應(yīng)用。教師充當引路者角色，將學生引入到一個新的領(lǐng)域；激發(fā)學生的興趣，通過主動的學習和研究獲取更高層次的科研素質(zhì)和能力。將教學融入科研，注重科研教學相長的教學模式探討，注重理論和實踐的滲透，注重本領(lǐng)域的發(fā)展確實和學科前沿的把握，提高學生分析問題和解決問題能力。筆者希望借此文喚起藥學教育界對多肽及生物藥物教學的重視，不斷更新知識，一同促進改領(lǐng)域教學水平的提高。