外泌體標(biāo)志物及臨床應(yīng)用研究*

李偉，吳佩佩，錢(qián)暉，許文榮

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

外泌體(exosome)是一類(lèi)直徑約為30～150 nm、起源于內(nèi)體的脂質(zhì)雙層囊泡，幾乎來(lái)源于所有類(lèi)型細(xì)胞中，并在體液(包括唾液、尿液、血液和母乳等)中大量存在。外泌體所包含的蛋白質(zhì)/脂質(zhì)和核酸等內(nèi)容物是一種新的細(xì)胞間通訊分子，外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的生物活性分子主要通過(guò)以下機(jī)制影響靶細(xì)胞：通過(guò)表面結(jié)合的配體直接激活靶細(xì)胞；將活化的受體轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞；通過(guò)功能蛋白、脂質(zhì)和RNA的傳遞對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行表觀遺傳重編程。另外在免疫系統(tǒng)中，外泌體還可參與抗原呈遞、免疫激活、免疫抑制以及通過(guò)外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通迅產(chǎn)生的免疫耐受性等免疫調(diào)節(jié)作用。由于外泌體與多種疾病的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)，外泌體相關(guān)的分子標(biāo)志物檢測(cè)在疾病的診斷及療效評(píng)估中優(yōu)勢(shì)突出。本文旨在對(duì)外泌體標(biāo)志物及其在臨床中的應(yīng)用研究進(jìn)行簡(jiǎn)要評(píng)述。

1 外泌體標(biāo)志物與腫瘤診斷

外泌體在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的基因突變、無(wú)限增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸等方面起著重要的作用[1]。外泌體在多種體液中的存在和穩(wěn)定性使其可以作為一種理想的可用于疾病診斷的非創(chuàng)傷性液體活檢指標(biāo)。循環(huán)體液中外泌體攜帶的與癌癥相關(guān)的生物信號(hào)分子或?qū)⒊蔀榘┌Y早期檢測(cè)和治療的新靶標(biāo)。

微小RNA(microRNA, miRNA)是非編碼RNA(non-coding RNA)中最為常見(jiàn)的一類(lèi)非編碼單鏈RNA分子，長(zhǎng)度約為19～24個(gè)核苷酸。研究顯示，miRNA是腫瘤外泌體檢測(cè)中較為常見(jiàn)的標(biāo)志物，如血液循環(huán)中表達(dá)升高的外泌體miR-21被證實(shí)與多種腫瘤相關(guān)，包括胰腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌及食管癌等[2]。腫瘤細(xì)胞來(lái)源外泌體miR-21的高表達(dá)可能與其參與的腫瘤血管生成有關(guān)。Liu等[3]發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞釋放的外泌體miR-21可通過(guò)轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)依賴(lài)機(jī)制，誘導(dǎo)周?chē)夤芗?xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的產(chǎn)生，從而促進(jìn)血管生成。Tanaka等[4]研究發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血清外泌體miR-21水平顯著高于對(duì)照組(P=0.000 9)，其進(jìn)一步以miR-21中位數(shù)水平作為截?cái)嘀担Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-21高表達(dá)患者與低表達(dá)患者病灶轉(zhuǎn)移的比例差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(30.8% vs 12%，P=0.041)，提示外泌體miR-21不僅具有作為食管癌的診斷潛力，也可以用于判斷疾病發(fā)展程度。除了血液外泌體分析外，尿液外泌體標(biāo)志物分析也可以用于臨床診斷，如Armstrong等[5]發(fā)現(xiàn)在膀胱癌患者中，尿液miR-21(r=0.88,P<0.001)和miR-4454(r=0.83,P<0.001)的表達(dá)水平顯著上調(diào)，且證實(shí)尿液和腫瘤細(xì)胞miRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.42,P<0.001)，提示膀胱癌患者尿液的外泌體具有一定的腫瘤特異性，具有良好的臨床診斷價(jià)值。

外泌體蛋白也可作為腫瘤的診斷標(biāo)志物。如Chen等[6]采用無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析乳腺癌患者和健康人對(duì)照血漿外泌體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)144種磷蛋白的表達(dá)水平顯著升高(FDR<0.05)。提示特定外泌體磷蛋白具有腫瘤特異性，具有作為腫瘤診斷生物學(xué)標(biāo)志物的潛力，但外泌體磷蛋白檢測(cè)的進(jìn)一步臨床應(yīng)用需要依賴(lài)于更多磷蛋白抗體的開(kāi)發(fā)。作為最為重要的腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)之一，凋亡抑制蛋白(survivin)也可作為腫瘤診斷標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。Gleichenhagen等[7]采用ELISA法和商業(yè)化試劑盒UBC?Rapid聯(lián)合檢測(cè)膀胱癌患者尿液survivin蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其篩查膀胱癌和健康人對(duì)照的ROC曲線(xiàn)下面積(AUCROC)值為0.84，敏感性和特異性分別為66%和95%；篩查高級(jí)別膀胱癌和健康人對(duì)照的AUCROC值為0.91，敏感性可提升至82%。但survivin的分泌也可能與炎癥發(fā)生相關(guān)，如何排除炎癥干擾是survivin用于膀胱癌診斷需要考慮的一個(gè)重要因素。目前已報(bào)道的可用于臨床診斷的其他外泌體蛋白包括用于肺癌診斷的脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)[8]、纖維連接蛋白(FN)[9]，用于乳腺癌診斷的重組人SH3-結(jié)構(gòu)域GRB2樣2蛋白(SH3GL2)、線(xiàn)粒體融合蛋白2(MFN2)[10]和用于胃癌診斷的三結(jié)構(gòu)域蛋白3(TRIM3)[11]等。

2 外泌體標(biāo)志物與神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷

外泌體已被證實(shí)與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展相關(guān)，包括阿爾茨海默病(AD)。Fiandaca等[12]檢測(cè)57例AD患者和57例健康人對(duì)照血液外泌體蛋白的水平差異，發(fā)現(xiàn)AD患者總tau蛋白含量(191±12.3 pg/mL,P<0.001)、P-T181-tau(106±6.1 pg/mL,P<0.000 1)、P-S396-tau(25.4±2.25 pg/mL,P<0.000 1)和Aβ1-42(18.5±2.97 pg/mL,P<0.000 1)均顯著高于健康人對(duì)照(分別為130±11.9 pg/mL,16.9±1.89 pg/mL,3.88±0.26 pg/mL和0.83±0.13 pg/mL)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AD患者確診時(shí)的血清P-T181-tau和P-S396-tau水平與AD患病前(1～10年)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Aβ1-42水平卻顯著升高，表明Aβ1-42或可提前1～10年預(yù)判AD的發(fā)生。

外泌體的miRNA在AD的診斷上也具有一定的應(yīng)用價(jià)值。Lugli等[13]等發(fā)現(xiàn)AD患者血漿外泌體中miR-342-3p(340.63 vs 547.94,t=0.003 9,P<0.05)和miR-23b-3p(285.73 vs 378.79,t=0.022 8,P<0.05)水平均與健康對(duì)照人群存在顯著性差異，提示血漿外泌體miR-342-3p和miR-23b-3p的顯著下調(diào)具有診斷AD的潛力。在腦脊液外泌體標(biāo)志物中，Riancho等[14]發(fā)現(xiàn)在18例AD患者和18例對(duì)照組腦脊液樣本中，miR-9-5p和miR-598在AD患者中的檢出率均為0%，而在對(duì)照組中的檢出率分別為50%(P=0.001)和75%(P<0.001)。提示腦脊液外泌體miRNA在AD診斷中具有潛在的臨床價(jià)值，但腦脊液取樣需要進(jìn)行局部麻醉后行腰椎穿刺，采樣便捷性要低于血樣采集。

Raoof等[15]通過(guò)一項(xiàng)大樣本量的回顧性研究，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體miR-27a-3p、miR-328-3p和miR-654-3p篩查遺傳性全面性癲癇(genetic generalized epilepsies，GGE)的AUCROC值分別為0.73,0.72和0.63，而三者聯(lián)合檢測(cè)可以提高至0.74。提示miR-27a-3p、miR-328-3p和miR-654-3p聯(lián)合檢測(cè)可以作為GGE篩查的潛在標(biāo)志物。此外，Martins-Ferreira等[16]發(fā)現(xiàn)miR-146a、miR-155和miR-132可能參與了GGE的病理過(guò)程，尤其是miR-155在癲癇患者體內(nèi)顯著升高(P<0.001)，可作為判斷癲癇進(jìn)展的重要指標(biāo)。隨著研究的進(jìn)一步深入，外泌體標(biāo)志物在癲癇的診斷方面有望得到進(jìn)一步應(yīng)用。

3 外泌體標(biāo)志物與感染性疾病診斷

在病毒和細(xì)菌感染的過(guò)程中，微生物以及被感染細(xì)胞均能產(chǎn)生外泌體，這些外泌體在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、擴(kuò)散感染、宿主細(xì)胞死亡、病原體清除及疾病診斷等方面發(fā)揮著重要的作用。因此，外泌體具有成為多種感染性疾病診斷生物學(xué)標(biāo)志物的潛力。

外泌體參與HBV感染的多個(gè)步驟并調(diào)控感染后的免疫反應(yīng)，某些外泌體miRNAs有望成為判斷肝組織炎癥的敏感生物學(xué)標(biāo)志物。例如，李榮華等[17]證實(shí)在持續(xù)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)正常的HBV患者中，肝組織炎癥分級(jí)≥A2和

外泌體標(biāo)志物在結(jié)核病的診斷方面也有一定的進(jìn)展。Diaz等[20]發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌(Mtb)感染可導(dǎo)致外泌體蛋白質(zhì)組分發(fā)生顯著變化，其中有41種蛋白質(zhì)顯著富集，包括熱休克蛋白90(HSP90), 波形蛋白(vimentin), 冠蛋白1C (coronin 1C)和膜突蛋白(moesin)等，并與膜蛋白呈顯著相關(guān)。Lin等[21]分別對(duì)肺炎、肺結(jié)核和肺癌患者胸腔積液外泌體的miRNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-378i在肺結(jié)核患者中的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，提示miR-378i在肺結(jié)核診斷中具有較高的應(yīng)用潛力。

4 外泌標(biāo)志物與心血管疾病診斷

心血管系統(tǒng)的多種細(xì)胞均可產(chǎn)生外泌體，外泌體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)與凝血等生物學(xué)功能在心血管系統(tǒng)的病理生理過(guò)程中具有重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、炎癥及缺氧狀態(tài)下均可增加外泌體的釋放，釋放的外泌體與促炎、促凝血因子及血栓形成有關(guān)，參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[22]。Wang等[23]檢測(cè)了65例動(dòng)脈粥樣硬化患者和68例健康人對(duì)照的血漿外泌體中長(zhǎng)鏈非編碼(LncRNA)低氧誘導(dǎo)因子1α反義鏈(HIF1 α-antisense RNA1，HIF1A-AS1)的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)患者血漿中HIF1A-AS1顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，HIF1A-AS1的表達(dá)與循環(huán)外泌體水平呈顯著相關(guān)性(r=0.875,P<0.001)，ROC曲線(xiàn)分析證實(shí)，血漿外泌體和HIF1A-AS1區(qū)分動(dòng)脈粥樣硬化和健康人對(duì)照的AUCROC值分別為0.861和0.823，提示循環(huán)外泌體和HIF1A-AS1檢測(cè)具有動(dòng)脈粥樣硬化的診斷潛力。

Jansen等[24]分析了181例冠心病患者的外泌體miRNA水平，發(fā)現(xiàn)外泌體中高表達(dá)miR-126和miR-199-a的患者可以降低心血管事件的發(fā)生率，其風(fēng)險(xiǎn)比(OR)分別為0.485和0.518(P<0.05)，進(jìn)一步行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示高表達(dá)miR-126的患者與低表達(dá)患者相比，首次心血管事件(major adverse cardiovascular event, MACE)的發(fā)生率顯著下降(P=0.007),miR-126高表達(dá)和低表達(dá)患者無(wú)MACE發(fā)生的8年生存率分別為79.5%和60.2%。提示外泌體miR-126和miR-199-a可以用于預(yù)判冠心病患者心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

5 外泌體與其他系統(tǒng)疾病診斷

除了在上述疾病中的診斷應(yīng)用外，外泌體作為診斷標(biāo)志物也在其他類(lèi)型的疾病上進(jìn)行了大量的研究。例如在自身免疫性疾病方面，Song等[25]發(fā)現(xiàn)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者體內(nèi)外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的外泌體HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA, hotair)水平明顯高于健康人對(duì)照，平均升高約4倍(1.6～6.5倍，P<0.001)。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)RA患者和健康人對(duì)照滑膜細(xì)胞外泌體中LncRNAs存在差異表達(dá)，其中LncRNA ENST00000483588上調(diào)，而LncRNA ENST00000438399、LncRNA uc004afb.1、LncRNA ENST00000452247下調(diào)，其篩查RA和健康人對(duì)照的AUCROC分別為0.85、0.92、0.97和0.92。提示這些LnRNAs的失調(diào)可能參與RA的病變過(guò)程。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡方面，Perez-Hernandez等[27]發(fā)現(xiàn)與健康人對(duì)照相比，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者尿液外泌體miR-146a的表達(dá)水平顯著上升(1 vs 15，P<0.01)。另外miR-146a鑒別診斷合并活躍期狼瘡腎炎SLE患者和無(wú)狼瘡腎炎SLE患者的AUCROC為0.960，當(dāng)cut-off值為15.3時(shí)，其敏感性為100%，特異性90%。提示尿液miR-146a水平可以作為SLE的疾病標(biāo)志物，同時(shí)也具有判定SLE進(jìn)展程度的潛力。

6 外泌體標(biāo)志物的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

6.1蛋白質(zhì)檢測(cè) 經(jīng)典的蛋白質(zhì)分析方法主要包括ELISA法和western blot，但二者并不適合于外泌體蛋白的檢測(cè)，目前檢測(cè)方法主要基于抗體、核酸適配體和蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)質(zhì)譜技術(shù)。隨著適配體技術(shù)的發(fā)展，需要復(fù)雜檢測(cè)準(zhǔn)備流程的抗體檢測(cè)的缺點(diǎn)越來(lái)越凸顯。蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)質(zhì)譜因其龐大的數(shù)據(jù)量以及操作的復(fù)雜程度也不適合于將來(lái)應(yīng)用于快速臨床檢測(cè)的需求。適配體檢測(cè)方法結(jié)合了成熟的核酸技術(shù)，其作用本質(zhì)是一段單鏈DNA或者RNA分子折疊形成特定三維結(jié)構(gòu)，并與生物靶標(biāo)高親和力和高特異性結(jié)合。核酸適配體同時(shí)具有特異性識(shí)別能力和基于PCR/HCR(雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的信號(hào)放大能力。相對(duì)于抗體而言核酸適配體的結(jié)合能力較低，有利于外泌體的洗脫，從而可以避免造成對(duì)外泌體形態(tài)學(xué)和功能分析的影響[28]。因此核酸適配體在外泌體的檢測(cè)中將起到越來(lái)越重要的作用。

6.2核酸檢測(cè) RNA是外泌體中起到關(guān)鍵作用的裝載物，而DNA的含量則相對(duì)較少[28]。外泌體純化后，可以采用多種商業(yè)化試劑盒進(jìn)行RNA的提取和純化。RNA的定量分析可以采用分光光度計(jì)通過(guò)芯片和軟件操作進(jìn)行分析。RNA的表達(dá)分析則可以通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)或基因芯片(microarray)進(jìn)行。對(duì)于極微量核酸樣本的檢測(cè)以及拷貝數(shù)變異狀態(tài)的分析，可以使用微滴式數(shù)字 PCR (droplet digital PCR，ddPCR)進(jìn)行分析，其靈敏度和精確度均高于 qPCR。二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing)可以分析外泌體中的全轉(zhuǎn)錄組，有助于發(fā)現(xiàn)新的有效序列。大多數(shù)RNA的檢測(cè)方法也可用于外泌體DNA的檢測(cè)。

6.3脂質(zhì)體檢測(cè) 細(xì)胞水平脂質(zhì)體的分析已有相對(duì)成熟的方法，但由于外泌體中脂質(zhì)體的功能有限，近年來(lái)關(guān)于脂質(zhì)體檢測(cè)方法創(chuàng)新的報(bào)道少見(jiàn)[28]。已有方法包括薄層色譜法(TLC)、液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、電噴霧電離質(zhì)譜法(ESI-MS)、氣相色譜電子轟擊質(zhì)譜法(GC-EI-MS)、液相色譜電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-ESI-MS/MS)等。

在外泌體的檢測(cè)未來(lái)發(fā)展上，微流控技術(shù)也是一個(gè)可能的方向。微流控技術(shù)只需要較小的樣本量，可以大大減少檢測(cè)的規(guī)模和成本以及操作的復(fù)雜度，能夠在較小的空間內(nèi)同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣本的快速檢測(cè)。通過(guò)實(shí)現(xiàn)微流控芯片的免疫捕捉功能，可以將微流控芯片和免疫磁珠兩者的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來(lái)[29]。磁珠-外泌體結(jié)合體可以結(jié)合一些表征分析技術(shù)，比如流式細(xì)胞術(shù)、電鏡等，從而實(shí)現(xiàn)在分離過(guò)程中同時(shí)檢測(cè)，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間。

生物傳感平臺(tái)，包括基于表面等離子共振技術(shù)(surface plasmon resonance technology, SPR)和表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS)的生物傳感器技術(shù)也有報(bào)道應(yīng)用于外泌體的檢測(cè)。Fan等[30]建立了 SPR成像生物傳感平臺(tái)，該平臺(tái)具有3個(gè)分別用不同抗體(CD63，EGFR 和 EpCAM)修飾的通道，可用于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)衍生的不同亞型的外泌體檢測(cè)。Zhang等[31]報(bào)道了一種快速靈敏的SERS生物傳感器，同時(shí)可以檢測(cè)外泌體上的多種蛋白質(zhì)標(biāo)記并進(jìn)一步進(jìn)行表型分析。

7 小結(jié)及展望

外泌體作為細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本方式之一，攜帶有蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等大量生物活性物質(zhì)，且具有穩(wěn)定性好、內(nèi)容物豐富、無(wú)創(chuàng)及檢測(cè)迅速的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)在腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的診斷和預(yù)后判斷中顯示出巨大的潛力[32]。但目前很多經(jīng)過(guò)初步研究發(fā)現(xiàn)的具有診斷潛力的外泌體標(biāo)志物仍缺乏大樣本量重復(fù)性驗(yàn)證的臨床確認(rèn)過(guò)程，在臨床上的廣泛應(yīng)用受到一定的限制。不同體液中的外泌體分離提取方法包括采集、預(yù)處理和保存等均影響檢測(cè)結(jié)果，因此獲取穩(wěn)定均一、易于標(biāo)準(zhǔn)化的體液外泌體提取方法是本領(lǐng)域重要挑戰(zhàn)之一。隨著不同類(lèi)型疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中外泌體參與機(jī)制的深入研究，高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，以及針對(duì)不同疾病類(lèi)型標(biāo)本采集方式的規(guī)范，外泌體標(biāo)志物將有望進(jìn)入廣泛的臨床應(yīng)用階段。