IL-13、IL-4及FCERIB基因多態(tài)性對(duì)吸入糖皮質(zhì)激素治療兒童哮喘療效的影響*

張炫煒，酈凡，姚建軍

(紹興第二醫(yī)院兒科，浙江紹興 312000)

哮喘是一種慢性呼吸道炎癥性疾病, 多于兒童期發(fā)病。炎癥與氣道高反應(yīng)性相關(guān),若延誤時(shí)機(jī)診治,隨病程遷移，患兒易發(fā)生不可逆性氣道損傷[1-2]。目前臨床上將吸入糖皮質(zhì)激素(inhaled corticosteroids, ICS)作為哮喘治療的長(zhǎng)期藥物, 多數(shù)患兒可從中獲益,但也存在部分患兒經(jīng)規(guī)范用藥后病情仍反復(fù),且肺功能呈漸進(jìn)性下降,治療效果存在個(gè)體差異[3]。此個(gè)體差異可能與患兒基因多態(tài)性有關(guān)。研究證實(shí)，IgE可反應(yīng)機(jī)體炎癥與過敏性反應(yīng)水平,是診斷哮喘的生物學(xué)標(biāo)志物之一[4]。免疫球蛋白E(mmunoglobulin E, IgE)主要通過FCER1B基因(又稱為MS4A2基因)活化肥大細(xì)胞，從而引發(fā)即時(shí)超敏反應(yīng)，參與過敏反應(yīng)機(jī)制[5]。IL-13主要通過促進(jìn)B細(xì)胞活化,對(duì)IgE合成調(diào)節(jié)及哮喘相關(guān)炎癥的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用[6]。IL-4基因可誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞合成IgE,在Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[7]。本研究基于IL-13、IL-4及FCER1B基因多態(tài)性與IgE水平相關(guān)以及ICS治療可以降低患兒血清總IgE水平,推測(cè)IL-13、IL-4及FCER1B基因多態(tài)性與患兒ICS治療效果存在一定的相關(guān)性,并對(duì)此展開分析。

1 研究對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集2020年1月至2022年1月紹興市第二醫(yī)院兒科救治的急性發(fā)作期哮喘患兒56例作為急性發(fā)作期組,其中男30例,女26例,年齡(8.24±1.35)歲；慢性持續(xù)期哮喘患兒52例作為慢性持續(xù)期組, 其中男28例,女24例,年齡(8.33±1.42)歲；臨床緩解期哮喘患兒53例作為臨床緩解期組,其中男27例,女26例,年齡(8.35±1.37)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》中哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；行ICS治療；臨床依從性好者。排除標(biāo)準(zhǔn)：先天性肺部疾病、先天性心臟病等患兒；異物吸入導(dǎo)致的喘息患兒；變態(tài)反應(yīng)性支氣管肺曲菌病、急慢性支氣管炎、支氣管淋巴結(jié)結(jié)核患兒。另選取同期體檢健康者60例作為健康人對(duì)照組，其中男32例,女28例,年齡(8.29±1.38)歲。本研究經(jīng)紹興市第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2020L0121),患兒家屬知情同意。

1.2主要儀器及試劑 DNA提取試劑盒(北京天根生化科技北京有限公司),IgE試劑盒(美國(guó)貝克曼庫爾特公司)。UniCel Dxl 800免疫分析系統(tǒng)(美國(guó)貝克曼庫爾特公司),UV1901PC分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司),ABI7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3樣本采集 將采樣拭子伸進(jìn)口腔, 緊靠臉頰內(nèi)側(cè)來回刮拭15次以上,并不時(shí)旋轉(zhuǎn)拭子,使其充分接觸口腔黏膜,最后將拭子頭部折斷后放入采集管,蓋緊管蓋,5 d內(nèi)常溫送檢。

1.4DNA提取及熒光定量PCR反應(yīng) 采用DNA提取試劑盒提取口腔脫落細(xì)胞樣本的DNA,分光光度法測(cè)定吸光度(A260 nm/A280 nm)比值,取DNA純度約為1.9,濃度為20 ng/μL的樣本,置于4 ℃保存。根據(jù)GenBank中IL-13基因的序列號(hào)(NM_051345.1),IL-4基因序列號(hào)(NC_051345.1),FCER1B基因序列號(hào)(NC_000011.10),用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,并送上海生工公司合成。引物序列見表1。PCR總反應(yīng)體系為25 μL,包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10×PCR buffer 2 μL,模板DNA 2 μL,Taq酶0.2 μL,無菌ddH2O補(bǔ)足體積。PCR循環(huán)參數(shù):95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s,共45個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。于60 ℃時(shí)收集FAM與HEX熒光。采用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)及結(jié)果分析。根據(jù)3個(gè)基因的熒光曲線判讀其基因型,由上?？漆t(yī)聯(lián)創(chuàng)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所完成多態(tài)性分析。

表1 引物序列

1.5血清IgE測(cè)定 取1.2中各組患者的血清標(biāo)本10 μL,由本院檢驗(yàn)科采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定治療前后臨床緩解期、慢性持續(xù)期、急性發(fā)作期哮喘患兒IgE水平差異,IgE參考區(qū)間：<100 IU/mL。

1.6ICS治療及隨訪 依據(jù)指南標(biāo)準(zhǔn)及患兒情況,給予入組患兒ICS治療(布地奈德200 μg,2次/天。治療觀察期為3個(gè)月,期間可根據(jù)病情按需吸入快速緩解藥沙丁胺醇?xì)忪F劑),并進(jìn)行常規(guī)療效評(píng)估檢測(cè),包含肺功能[1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second, FEV1)、1秒用力呼氣容積與最大肺活量比值(ratio of forced expiratory volume in one second to maximum vital capacity, FEV1/VCmax)、用力呼出50%肺活量時(shí)的平均呼氣流速(average expiratory flow rate when forced expiratory 50% vital capacity, MEF50)]、呼出氣一氧化氮(exhaled nitric oxide, Fe-NO)檢測(cè)及兒童哮喘控制測(cè)試量表(Asthma Control Scale for Children, C-ACT)評(píng)分，并計(jì)算各指標(biāo)的Δ值(治療后的肺功能改善值減去治療前的值得到的差值)。根據(jù)C-ACT評(píng)分結(jié)果將慢性持續(xù)期哮喘患兒及臨床緩解期哮喘患兒分為控制組(25分)49例、部分控制組(20～24分)37例和未控制組(<20分)19例。

2 結(jié)果

2.1治療前后各組哮喘患兒血清IgE水平變化 與治療前相比, 臨床緩解期、慢性持續(xù)期、急性發(fā)作期哮喘患兒在治療后血清IgE水平均降低(335.42±37.34 IU/mL vs 158.71±28.38 IU/mL, 446.71±40.95 IU/mL vs 166.92±29.56 IU/mL, 681.52±96.57 IU/mL vs 435.17±62.15 IU/mL,t值分別為28.195,39.949,15.617,P均<0.05)。

2.2各研究對(duì)象基本資料與基因多態(tài)性分析結(jié)果 健康人對(duì)照組、臨床緩解期、慢性持續(xù)期+急性發(fā)作期患兒IL-13、IL-4、FCERIB基因表達(dá)型差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表2～表4。

2.3哮喘患兒IL-13、IL-4及FCERIB基因各基因型肺功能比較結(jié)果IL-13基因rs20541位點(diǎn)GG型ΔFEV1、ΔFEV1/VCmax、ΔMEF50水平高于GA型與AA型(P<0.05),而ΔC-ACT水平GG型、GA型高于AA型(P<0.05)；IL-4基因rs2243250位點(diǎn)CC型ΔFEV1、ΔFEV1/VCmax、ΔMEF50、ΔFe-NO、ΔC-ACT水平高于CT型與TT型(P<0.05)；FCERIB基因rs569108位點(diǎn)AA型ΔFEV1、ΔFEV1/VCmax、ΔMEF50、ΔC-ACT水平高于AG型與GG型,見表5～表7。

2.4不同治療效果哮喘患兒IL-13、IL-4及FCERIB基因多態(tài)性分布IL-13基因rs20541位點(diǎn)控制組AA型、A等位基因比例,IL-4基因rs2243250位點(diǎn)控制組T等位基因比例,FCERIB基因rs569108位點(diǎn)GG型、G等位基因比例均低于未控制組(χ2分別為4.902,19.781,7.451,5.127,11.977,P<0.05),見表8～10。

表8 IL-13基因rs20541位點(diǎn)多態(tài)性與臨床療效關(guān)系[n(%)]

表9 IL-4基因rs2243250多態(tài)性與臨床療效關(guān)系[n(%)]

表10 FCERIB基因rs569108多態(tài)性與臨床療效關(guān)系[n(%)]

3 討論

哮喘是多在兒童期發(fā)病的氣道非特異性炎性疾病,嚴(yán)重影響患兒生活質(zhì)量甚至生存。ICS是治療哮喘的有效方式,但是部分患兒無法從中獲益,個(gè)體化差異的原因可能與基因多態(tài)性有關(guān)。哮喘患兒呈現(xiàn)氣道高反應(yīng)特性,血清高IgE水平與氣道高反應(yīng)性相關(guān),IgE作為分泌性免疫球蛋白,是引發(fā)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的主要抗體,哮喘患兒較健康人血清中IgE的含量明顯升高[9]。因此，檢測(cè)血清IgE水平對(duì)評(píng)估患兒病情以及治療反應(yīng)性有較大幫助,有利于哮喘的防治。本研究中不同哮喘分期患兒血清IgE水平差異顯著,急性發(fā)作期、慢性持續(xù)期、臨床緩解期患兒血清IgE水平呈下降趨勢(shì),且經(jīng)ICS治療后, 患兒IgE水平下降,提示IgE水平與患兒療效相關(guān),與李云等[10]的研究結(jié)果基本一致。

總IgE水平很大程度上取決于遺傳因素,有研究顯示，F(xiàn)CER1B-109C/T啟動(dòng)子多態(tài)性是影響血清總IgE的因素[11]。Oh等[12]研究顯示,韓國(guó)哮喘兒童血清IgE水平與FCER1B654C/T多態(tài)性有關(guān)；de Guia等[13]研究顯示,反應(yīng)性鼻炎患兒FCER1Brs569108的基因位點(diǎn)多態(tài)性與血清IgE水平呈高度相關(guān)性。張平波等[14]研究顯示,FCER1Brs569108位點(diǎn)基因多態(tài)性與哮喘預(yù)測(cè)指數(shù)及特應(yīng)性相關(guān)。但FCER1Brs569108位點(diǎn)基因多態(tài)性是否與患兒ICS治療效果有關(guān)尚缺乏證據(jù)。本研究顯示，哮喘患兒FCER1Brs569108 A/G突變率顯著高于健康人對(duì)照組,與張平波等[14]研究結(jié)果類似,哮喘患兒FCER1Brs569108位點(diǎn)存在AA型、AG型、GG型,進(jìn)一步通過隨訪發(fā)現(xiàn)患兒經(jīng)ICS治療后取得良好效果,肺功能有效提高,Fe-NO下降,C-ACT評(píng)分上升。但各基因型治療效果存在差異,AA型患兒對(duì)ICS治療反應(yīng)性更好,AG型次之,GG型更差,控制組AA型所占比例更高,提示位點(diǎn)A/G突變會(huì)降低患兒對(duì)ICS的治療效果,此基因型患兒應(yīng)選取其他治療方案。

IL-4和IL-13基因多態(tài)性也可顯著影響血清中的IgE水平,從而使得哮喘的發(fā)病危險(xiǎn)性升高[15]。IL-13主要通過促進(jìn)B細(xì)胞活化,對(duì)IgE合成調(diào)節(jié)以及哮喘相關(guān)炎癥的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。IL-4可誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞合成IgE,在Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。有研究表明,IL-13rs20541位點(diǎn)的變異與血清IgE總水平升高及哮喘有關(guān)[16],龍易勤等[17]的一項(xiàng)研究顯示，攜帶IL-4基因rs2243250野生型AA位點(diǎn)的哮喘病患兒體內(nèi)表達(dá)的IgE水平遠(yuǎn)高于對(duì)照兒童。本研究中IL-4rs2243250、IL-13rs20541位點(diǎn)基因多態(tài)性與患兒的發(fā)病以及ICS治療效果相關(guān),治療前各基因型患兒肺功能、Fe-NO水平、C-ACT評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但I(xiàn)L-4rs2243250 CC型、IL-13rs20541 GG型對(duì)ICS治療效果更好,肺功能改善情況、Fe-NO下降情況,C-ACT評(píng)分升高水平均高于各自的其他基因型,控制組患兒中IL-4rs2243250 CC型、IL-13rs20541 GG型比例更高。提示IL-4rs2243250位點(diǎn)C/T突變、IL-13rs20541 G/A突變會(huì)降低患兒ICS的治療效果,患兒需考慮更換治療方案,提高療效,改善哮喘發(fā)作癥狀。

綜上所述,FCER1Brs569108、IL-4rs2243250、IL-13rs20541基因多態(tài)性與哮喘患兒ICS療效相關(guān),該3個(gè)基因位點(diǎn)突變可能有助于預(yù)測(cè)哮喘患兒的ICS治療效果,據(jù)此提供適合的個(gè)體化治療方案,改善患兒的生存治療。本研究也存在一定不足之處,如未進(jìn)行FCER1B與IL-4、IL-13基因之間的相互機(jī)制研究等，今后仍需進(jìn)一步分析。