miR-124在卒中后腦缺血損傷與修復中的作用及機制研究進展

王 眾，李可心，孫妍玉，吳 晉

南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院神經內科，江蘇 南京 210011

腦卒中是成人因病致死和致殘的主要原因之一，缺血性卒中占70%以上［1］。目前臨床針對該類疾病的有效治療藥物是使用組織型纖溶酶原激活劑對患者進行溶栓治療，但是由于種種條件的限制，僅約6%的患者能夠接受溶栓療法［2］。隨著機械取栓技術的成熟，更多的缺血性卒中患者得到救治，病死率逐年下降，大部分幸存者轉化為慢性局灶性功能障礙［2］，遺憾的是目前臨床尚缺乏促進卒中后功能修復的藥物。

微小RNA-124（microRNA-124，miR-124）是一種在大腦皮層和小腦中特異性表達最豐富的miRNA［3］，在神經干細胞中表達水平較低，而在分化成熟的神經元中顯著高表達，在神經元的突觸聯系和發(fā)育進程中發(fā)揮著不可或缺的作用。缺血性腦卒中后，miR-124 在體液和組織中的表達發(fā)生明顯改變，廣泛參與缺血性卒中后的多種病理生理過程，靶向調控分子水平和病理過程以減輕腦缺血損傷，促進功能修復［4-7］。本文就miR-124 對缺血性卒中的作用及機制研究進展做一綜述，旨在為缺血性卒中提供新的標志物和可能的治療思路。

1 miR-124作為治療預后標志物

Sun等［8］選取急性缺血性卒中患者與健康人群，檢測血清miR-124表達水平，結果提示在缺血后24 h內miR-124 迅速下降，48～72 h 內逐漸升高，這與既往在動物MACO模型中檢測到的miR-124變化情況略有差異，但變化趨勢完全相同。多項研究證明，卒中患者的血清、血漿、腦脊液以及死于卒中的患者大腦樣本中miR-124的表達水平均顯著升高［8-11］，且miR-124表達水平與卒中后的梗死體積和腦損傷程度呈正相關［10-11］。缺血性卒中后血清miR-124水平升高是腦組織受損后釋放miR-124 進入體液的結果，因而miR-124 水平與病變大小顯著相關。同時，Rainer 等［12］發(fā)現缺血性卒中超早期（＜6 h）血漿miR-124 的變化程度可以預測患者3個月的復發(fā)率和死亡率。這些研究證明miR-124有望成為缺血性卒中早期敏感的輔助診斷和評估治療預后的生物標志物。

2 miR-124的作用機制

缺血性腦損傷后，組織中氧、糖獲得障礙，觸發(fā)原發(fā)和繼發(fā)性損傷，包括多種類型的細胞反應、缺血再灌注損傷以及血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）破壞等，最終導致局灶性神經功能缺陷，甚至死亡［9，13］。中風后根據時間分為3個不同的時期：急性期（2周內）、恢復期（2周～3個月）和后遺癥期（3個月后）［14］，miR-124有望治療缺血性卒中的機制在于其發(fā)揮了減輕急性期腦缺血損傷和促進恢復期功能修復的作用（圖1）［9］。

圖1 miR-124調節(jié)氧化應激、神經炎癥、細胞凋亡和功能修復的信號通路Figure 1 Signaling pathways underlying the roles of miR-124 in regulating oxidative stress，neuroinflammation，apoptosis and functional repair

2.1 miR-124與氧化應激

在血流缺失的超早期（＜24 h），過多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生介導了氧化應激過程并激活急性期神經內源性炎癥反應，ROS 和炎癥因子的釋放破壞了細胞外基質和連接蛋白，產生廣泛性細胞損傷，神經細胞進行性死亡［15］。ROS 主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）作用生成，ROS 過量產生引起的氧化應激狀態(tài)激活了NF-κB 通路，合成早期促炎細胞因子，增強神經炎癥［13］，在NOX 家族的7 個成員中，NOX2 和NOX4被認為是再灌注8～16 h內ROS的主要來源。體外、體內實驗顯示，神經元中的miR-124-5p 直接與CYBB（合成NOX2的基因）的3′UTR結合，負向調節(jié)NOX2水平［16］，減少ROS的產生和脂質、核酸的過氧化，并抑制NF-κB 通路誘導的神經炎癥，縮小梗死面積［6］。泛素特異性蛋白酶14（ubiquitin-specific proteases14，Usp14）是一種去泛素化的蛋白質，是蛋白酶體活性的主要調節(jié)因子，Min等［17］證實miR-124靶向抑制Usp14，改變細胞靜息狀態(tài)，增強蛋白酶體活性，從而減少氧化應激誘導的細胞死亡。miR-124平衡了自由基的產生和消除，避免了氧化應激導致的直接損傷。

2.2 miR-124與神經炎癥

缺血后炎癥反應是缺血性卒中急性期廣泛性細胞死亡的關鍵病理生理機制，炎癥反應早期小膠質細胞激活，向不同表型M1型和M2型極化［18］。早期小膠質細胞向M2型極化，清除細胞碎片，釋放神經保護性營養(yǎng)因子和抗炎介質，卒中晚期具有促炎性的M1 型細胞釋放促炎因子，對組織造成炎癥損害。因此，抑制小膠質細胞的過度反應、調節(jié)M1/M2的極化有益于神經恢復。動物實驗中，通過外泌體能靶向遞送大量miR-124 至腦組織，直接抑制腦損傷后的Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4），促進其向M2 極化，改善功能恢復［5］。同樣，缺血性卒中后腦內注射miR-124通過促使小膠質細胞轉變?yōu)镸2抗炎表型釋放抗炎因子，如白介素（interleukin，IL）-10、IL-4和IL-13，并激活T細胞來抑制炎癥的發(fā)展［19］。miR-124 顯著降低炎癥因子如TLR4、NF-κB和小膠質細胞激活標志物IBA1的表達，減輕小膠質細胞激活引起的炎癥［20］，改善缺血性中風后的抗炎作用和長期功能預后。上述研究提示miR-124可能作為一種新的抗炎調節(jié)劑。

2.3 miR-124與細胞凋亡

隨著早期炎癥反應的發(fā)生，細胞因子誘導免疫細胞激活，卒中后1 周遲發(fā)性神經細胞死亡（凋亡）啟動，JAK2/STAT3 通路是神經細胞凋亡的典型調節(jié)通路［21］，Hu 等［22］發(fā)現腦缺血再灌注損傷急性期miR-124 靶向抑制JAK2 的激活及下游STAT3 的磷酸化，發(fā)揮抗凋亡作用，提高神經細胞存活率。雖然缺血再灌注損傷后，miR-124的表達水平升高，但隨著缺血再灌注損傷的加重，其代償作用減弱。而注射外源性miR-124 直接抑制STAT3 蛋白，顯著降低了細胞凋亡相關蛋白的表達［23］。同時，miR-124通過靶向激活Wnt/β-catenin 信號通路，上調抗凋亡蛋白Bcl-2 表達、抑制促凋亡蛋白Bax表達來減少大鼠腦缺血區(qū)的神經細胞凋亡，減輕神經細胞損傷，減少功能缺損［24］。miR-124 激活Wnt/β-catenin 通路后抑制腦缺血再灌注區(qū)神經元的凋亡而改善氧化應激的神經損傷，顯著提高神經干細胞的再生水平［25］。這些結果證明了miR-124 具有早期抗凋亡作用，降低腦損傷體積。

不同研究者對miR-124調節(jié)PI3K/Akt途徑調控細胞凋亡作用的認識有差異［4，26-27］。Wang 等［4］觀察到miR-124 激活PI3K/Akt 發(fā)揮抗凋亡作用，通路激活后上調Bcl-2，減輕缺血性卒中細胞損傷和壞死。同時，miR-124 激活PI3K/Akt/Nrf2 途徑增加熱休克蛋白的表達，抑制氧化應激和凋亡過程，保護PC12細胞免受氧-糖剝奪復氧（OGD/R）損傷［26］。而另一個研究發(fā)現，梗死后升高的miR-124負向調控PI3K/Akt信號通路，促進Bax和炎癥因子Caspase-3的表達，加重神經元活力下降和軸突損傷［27］。因此，miR-124調節(jié)細胞凋亡的機制尚需更多研究來證實。

2.4 miR-124與功能修復

卒中后僅通過損傷后代償性激活的神經元前體向神經元分化來對受損腦組織進行修復是不夠的，一個有希望的途徑是優(yōu)化卒中急性期至后遺癥期的神經分化、增殖過程，以促進自我修復。miR-124可以通過靶向抑制DACT1 的表達來激活Wnt/βcatenin 通路，最終促進損傷后早期神經干細胞存活和向神經元分化［28］。在實施OGD/R 前預先抑制miR-124 表達，可顯著激活PI3K/Akt/mTOR 通路，加強蛋白質合成和轉錄，促進損傷后軸突生長［29］。而Wang 等［30］也證實了miR-124 靶向調節(jié)腦源性神經營養(yǎng)因子的表達，持續(xù)調控神經元再生、發(fā)育和可塑性。Song等［31］應用miR-124抑制Usp14，調節(jié)突觸活性，促進突觸重塑、神經元連接和神經血管再生。這些研究提示miR-124是改善早期神經功能恢復的重要靶點。

急性期之后是炎癥反應減弱和可塑性最大的恢復期，在嚙齒類動物中持續(xù)大約1個月，在人類腦卒中后持續(xù)長達3個月，隨著時間進展，可塑性逐漸降低，在后遺癥期誘導康復的潛力有限［14］。卒中恢復期JAK2/STAT3 的激活促進星形膠質細胞生長，膠質纖維酸性蛋白表達增強，形成膠質瘢痕，阻礙神經元再生。miR-124 與STAT3 的3′UTR 結合，直接抑制STAT3 表達，在MCAO 小鼠模型中，注射外泌體搭載的miR-124 后，STAT3 和p-STAT3（STAT3的活化形式）水平較注射前明顯降低，膠質纖維酸性蛋白表達明顯下調，神經瘢痕形成減少［7，31］。Notch 通路是細胞增殖、分化和成熟組織的凋亡中的重要調節(jié)通路，同時也是維持神經系統(tǒng)發(fā)育功能的主要調節(jié)因子［32］。miR-124 通過調節(jié)Notch 通路來促進缺血損傷后的神經干細胞的定向增殖和分化，優(yōu)化神經生發(fā)過程，以調節(jié)腦功能和促進視覺系統(tǒng)的再生，加快自我修復［28，33］。其中可能的機制是缺血誘導后，升高的miR-124 直接靶向和抑制Notch1 受體，增加下游轉錄因子Sox2 水平，觸發(fā)星形膠質細胞中潛在的神經再分化程序，將星形膠質細胞逆轉化為神經干細胞，進一步分化為功能完善的神經元，減少膠質瘢痕產生，直接參與卒中后神經網絡的重建［7］。

3 miR-124治療缺血性卒中臨床轉化的可能性

雖然有證據支持miR-124是治療中樞神經系統(tǒng)疾病和損傷的一種有前途的治療藥物，但BBB限制了其進入大腦，如體外實驗顯示負載miR-124 的納米顆粒增加了體外神經元細胞的存活和神經元分化，但在動物體內并沒有改善中風預后［34］。因此在使用miR-124 治療急性卒中之前，需要明確其給藥方式。目前的問題是需要設計一種跨越BBB 的miR-124 遞送系統(tǒng)，實現組織/細胞特異性靶向，已經開發(fā)了幾種方法將miRNA 輸送到中樞神經系統(tǒng)用于治療炎癥、腦卒中和帕金森病，包括外泌體、納米顆粒、腺相關病毒［35］。裝載miR-124的外泌體能被特異性遞送至中樞神經系統(tǒng)，并促進神經發(fā)生［35］。

外泌體是30～100 nm 的囊泡，是細胞外小泡的主要類型［20］。外泌體顆粒的小尺寸和高脂成分有助于它們通過BBB 轉運活性物質（胞漿蛋白、脂質和RNA 等），在細胞間高效穿梭或運送小分子到大腦中特定的靶細胞群，以介導疾病和損傷后的大腦重構，同時神經細胞分泌的外泌體被發(fā)現有助于缺血性中風后局部突觸的重塑［36］。目前已經發(fā)現外泌體可將幾種miRNA 模擬物和抑制劑有效輸送到大腦，并可以保護中樞神經系統(tǒng)免受損傷［37］。而將攜帶miR-124 的外泌體注射到梗死區(qū)，可極大地促進前體細胞向神經元分化，減輕缺血性卒中后的皮層損傷［38］。miR-124 在M2 型小膠質細胞的外泌體中含量豐富，可靶向送至腦內被神經元攝取，促進神經生發(fā)，并下調Usp14來減輕神經元凋亡，保護神經元免受缺血再灌注損傷［31］。除了促進小膠質細胞向M2型極化，靜脈注入外泌體miR-124還可以抑制神經細胞炎癥和神經元自噬，促進神經發(fā)生，改善腦損傷后的認知和預后［5，39］。這些研究表明，外泌體可能成為外源性miRNA進入腦內的載體，外泌體搭載miR-124可能是治療缺血性卒中的潛在方法。

4 總結與展望

缺血性腦損傷涉及的細胞和分子變化提供了大量潛在的生物標志物和治療靶點?；趍iRNA調控多種分子及信號通路表達的特性，miRNA 研究已經成為治療缺血性腦損傷的熱門領域。盡管miR-124 在缺血性卒中的治療中仍有不同的結論，有待進一步研究，但miR-124 在中樞神經系統(tǒng)疾病中的生物學意義和治療作用日益明顯，同時外泌體有望作為藥物載體和跨BBB 的輸送載體。為了使miR-124更安全、有效地用于缺血性卒中的診治，需要實現其組織/細胞特異性靶向，提供更高的穩(wěn)定性和避免潛在的靶外效應，以及根據個體特征確定治療窗口和治療模式，基于miRNA藥物的系統(tǒng)藥代動力學也許能提供新的思路?？傊F有的研究表明miR-124為缺血性卒中的診治提供了新思路。