改良多重PCR在流感病毒檢測中的應(yīng)用

張輝 邸紅芹 吳海峰 孫紅梅 孟自立 劉戰(zhàn)地

流行性感冒病毒(influenza virus，IFV)是正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的代表種，簡稱流感病毒，為分節(jié)段(8個節(jié)段)的負鏈RNA病毒，基于流感病毒核殼蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)抗原決定簇的差異，分為三種不同型：A型、B型和C型，是引起流行性感冒的病原體。流感病毒會造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速的傳播，在世界各地常有周期性的流行，特別是對老人和兒童等人群的生命健康造成了重大威脅[1,2]。其中A型流感病毒(influenza virus A，IFA)和B型流感病毒(influenza virus B，IFB)是引起人感染的主要病毒，甲型流感病毒易發(fā)生變異，流感大流行就是就是甲型流感病毒出現(xiàn)新亞型或舊亞型重現(xiàn)引起的[3,4]；乙型流感病毒根據(jù)抗原特異性和血凝素(HA1)基因的核苷酸序列，可以分為Yamagata和Victoria兩大譜系[5]，其感染特點是起病急驟、畏寒發(fā)熱，體溫在數(shù)小時至24 h內(nèi)升達高峰，39～40℃甚至更高，伴頭疼，全身酸疼，呼吸道癥狀較輕，咽干喉痛。流感病毒是國際上第一個全球監(jiān)測的傳染病毒[6]，國家流感中心每周都會報告新發(fā)病例及感染病毒類型，但至今尚未完全控制。流感病毒快速、精確及敏感的診斷，可為臨床醫(yī)師早期有效地抗病毒治療提供依據(jù)，同時高危人群可盡早的采取防護措施，減少病毒在人群中流行。傳統(tǒng)的檢測方法，如雞胚組織培養(yǎng)接種以及血清學(xué)診斷，由于其操作過程繁瑣、靈敏度低以及檢測時間較長，無法滿足快速診斷的要求，并且病毒抗原的變異頻率很高、傳播快速為流感病毒的精準診斷和有效防控帶來極大的困難。病毒簡便、精確及敏感的診斷手段就表現(xiàn)得極其重要。近年來，隨著分子生物學(xué)檢測方法的介入，給臨床流感病毒診斷和治療提供很大的幫助，尤其是多重實時熒光定量PCR技術(shù)(MRT-PCR)以其高通量、高靈敏性、高特異性及操作快速簡便等優(yōu)勢，在流感病毒診斷中有巨大的應(yīng)用空間[7,8]。多重PCR體系中存在多對引物和探針，在反應(yīng)過程中容易造成引物探針交叉干擾，導(dǎo)致擴增效率降低，因此，本文基于同源加尾系統(tǒng)(Homo-Taq Assidted Non-Dimer，HAND)建立改良的Taqmam-分子燈標(Taqman-MB)多重實時熒光定量PCR檢測IFA和IFB，以甲/乙型流感病毒核酸檢測試劑盒(中山達安基因)為參照，評估已構(gòu)建的改良多重?zé)晒舛縋CR體系在臨床檢測中的效能[9]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年11月至2019年2月于河北省胸科醫(yī)院就診患者261例，其中男161例，女100例；年齡7～89歲，平均(53.22±5.51)歲，為此次研究對象，患者均采集咽拭子標本，置于3 ml病毒保存管中，4℃冰箱保存，24 h內(nèi)檢測。所有入選患者符合體溫>37.5℃，并伴有以下癥狀之一：頭痛、關(guān)節(jié)疼痛、肌肉痛、咳嗽、喉嚨痛及流涕乏力等流感樣全身癥狀，此次研究獲得了倫理委員會的同意與支持。

1.2 儀器與試劑 本次研究中所用的儀器試劑：Ⅱ級生物安全柜(新加坡esco公司，設(shè)備型號LB2-4B1)；低溫高速離心機(德國艾本德公司，設(shè)備型號5424R)；全自動實時熒光定量PCR儀(美國伯樂公司，設(shè)備型號CFX96 Deep Well)；全自動核酸提取儀(德國凱杰公司，設(shè)備型號QIAcube connect)；醫(yī)用冷藏冷凍冰箱(日本松下公司，設(shè)備型號MPR-440F)；微量移液器(德國艾本德公司)；核酸提取試劑盒(德國凱杰公司，試劑盒型號RNeasy Mini Kit)；甲型/乙型流感病毒核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法，購自中山達安基因有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取:根據(jù)RNA提取試劑盒說明書(凱杰)，提取病毒總核酸，步驟如下：吸取200 μl樣本置于核酸提取管內(nèi)并加入4 μl甲型流感毒/乙型流感病毒內(nèi)標溶液，放置與核酸提取儀樣本盤內(nèi)，設(shè)定好提取程序，進行核酸提取。所提取的核酸應(yīng)立即檢測，若24 h內(nèi)能檢測可置于-20℃冰箱保存，若長期保存需置于-70℃冰箱。

1.3.2 核酸檢測:改良多重?zé)晒舛縋CR檢測體系為25 μl，依次為：預(yù)混的PCR反應(yīng)buffer 17 μl、酶混合液3 μl以及提取的核酸5 μl。PCR反應(yīng)程序為50℃，15 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；95℃，10 min(熱啟動)；95℃，15 s(變性)，62℃，25 s(退火)，72℃ 20 s(延伸)，5個循環(huán)(富集)；95℃，15 s(變性)，62℃，30 s(退火，收集熒光)，72℃ 20 s(延伸)，45個循環(huán)(擴增)，檢測通道為FAM和HEX。中山大學(xué)達安基因股份有限公司生產(chǎn)的甲型和乙型流感病毒核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)根據(jù)說明書，簡要步驟如下：反應(yīng)體系為25 μl，其中包括甲流或乙流反應(yīng)預(yù)混液17 μl、酶混合液3 μl以及提取的核酸5 μl。PCR反應(yīng)程序為，50℃，15 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；95℃，10 min(熱啟動)；94℃，15 s(變性)，58℃，45 s(退火，收集熒光)，45個循環(huán)(擴增)，檢測通道為FAM，HEX(內(nèi)標檢測通道)。

1.3.3 結(jié)果判讀:PCR擴增結(jié)束后，改良多重PCR結(jié)果使用熒光定量PCR儀自帶軟件進行分析，所有陰性樣本的信號值都應(yīng)低于閾值；若擴增Ct值>35，樣本低于檢測閾值線，結(jié)果判定為甲型或乙型流感病毒核酸陰性；若擴增Ct值≤35，結(jié)果判定為甲型或乙型流感病毒核酸陽性。中山達安基因檢測試劑盒根據(jù)說明書進行結(jié)果判讀，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)基線的開始和結(jié)束值(一般開始值設(shè)定為3～15，結(jié)束值可設(shè)5～20，調(diào)整陰性對照的擴增曲線水平或低于閾值限)，分析結(jié)果。如果檢測反應(yīng)體系在FAM通道無擴增或者有擴增曲線且Ct值>39.7，HEX通道Ct值≤44.5，判定為甲型流感病毒陰性，樣本未檢測到甲型流感病毒核酸，濃度低于檢測靈敏度，反之檢測Ct值≤39.7，HEX通道有或無擴增曲線，判定為甲型流感病毒陽性，樣本檢測到甲型流感病毒核酸；如果檢測反應(yīng)體系在FAM通道無擴增或者有擴增曲線且Ct值>38.0，HEX通道Ct值≤44.5，判定為乙型流感病毒陰性，樣本未檢測到乙型流感病毒核酸，濃度低于檢測靈敏度反之，檢測Ct值≤38.0判定為乙型流感病毒陽性，樣本到乙型流感病毒核酸。

2 結(jié)果

2.1 改良多重PCR檢測結(jié)果判讀 PCR擴增結(jié)束后，改良多重PCR結(jié)果使用熒光定量PCR儀自帶軟件進行分析，所有陰性樣本的信號值都應(yīng)低于閾值。見表1。

表1 改良多重PCR檢測結(jié)果判讀

2.2 流感核酸檢測結(jié)果 在261例發(fā)熱伴流感樣癥狀患者咽拭子標本中，改良多重PCR法檢出流感核酸陽性163例，陽性率62.5%，其中甲型流感病毒陽性156例，陽性率 59.8%，乙型流感病毒陽性7例，陽性率2.7%。達安基因試劑盒檢出流感核酸陽性169例，陽性率64.8%，其中甲型流感病毒陽性161例，陽性率61.7%，乙型流感病毒陽性8例，陽性率3.1%。改良多重PCR法與達安基因試劑盒檢出甲型流感陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.20，P=0.65)，改良多重PCR法與達安基因試劑盒檢出乙型流感陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.07，P=0.80)。見表2。

表2 達安基因和改良多重PCR法檢測陽性結(jié)果比較 例(%)

2.3 改良多重?zé)晒舛縋CR性能分析 與達安基因檢測試劑盒相比，改良多重PCR檢測甲型流感和乙型流感敏感性分別為97.5%和87.5%，特異性均為100%，兩種檢測方法檢測甲型流感病毒(Kappa=0.97，P=0.02)和乙型流感病毒(Kappa=0.93，P=0.07)均具有很高的一致性。見表3。

表3 改良多重PCR法與達安基因試劑盒檢測結(jié)果比較 例

3 討論

流行性感冒是由流感病毒引起的常見呼吸系統(tǒng)疾病，其具有爆發(fā)突然、高傳染性及流行性廣等特點[10-12]。流感病毒的快速檢測，一方面在早期鑒別診斷中起重要作用，可輔助臨床醫(yī)生盡早的制定合適的治療方案，控制患者病情發(fā)展同時也避免陰性患者的過度治療，另一方面，可作為流感病毒爆發(fā)期高通量、快速篩查地手段，為臨床提供依據(jù)，及時鑒別流感病毒感染，采取措施阻斷流感病毒傳播，避免疫情擴大。

常規(guī)的檢測血清學(xué)檢測和細胞培養(yǎng)無法早期快速檢出流感病毒，多種新的診斷手段被流感用于病毒的診斷，如實時熒光定量PCR[13]、恒溫擴增[14-16]以及芯片技術(shù)[17-19]等。史志坤[20]討論了實時熒光定量PCR儀在流感病毒檢測中的效果，210例流感樣患者標本檢測顯示熒光定量PCR法檢出率要顯著高于細胞培養(yǎng)法，可快速有效的檢出流感病毒核酸，成為高效簡便地診斷方式。熒光定量PCR由于其快速、靈敏、簡便及特異等優(yōu)勢，越來越多的研究表明，其可以作為一種檢測“金標準”用于流感病毒的鑒定，同時雙重、三重甚至多重?zé)晒釶CR檢測技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用，大大提高了病原體的檢測效率和檢測準確度[21-24]。

為了提高流感病毒檢出率和特異性，多種改良優(yōu)化的檢測方法用于流感病毒的檢測領(lǐng)域，高蕾等[25]采用具有高擴增效率的逆轉(zhuǎn)錄酶進行PCR反應(yīng)體系優(yōu)化，進行批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗，顯示優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)試劑，縮短了PCR反應(yīng)時間，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。常曉松等[26]基于熒光免疫層析法建立甲型流感病毒快速檢測技術(shù)，結(jié)果顯示熒光免疫層析試劑具有準確度高、檢測范圍寬、重復(fù)性和熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可用于流感病毒的快速篩查。本研究構(gòu)建的多重?zé)晒舛縋CR集合了多重PCR和實時熒光定量PCR的優(yōu)點，可以在單一體系中快速、簡便地檢測多種靶序列，但是由于PCR反應(yīng)體系中存在多對引物和探針，在PCR反應(yīng)過程中會導(dǎo)致引物探針間的交叉干擾，如背景熒光值高和引物二聚體的形成，嚴重的干擾PCR擴增。

本研究中我們采用了改良的Taqmam-MB探針(Taqman-分子燈標探針)，探針保留了分子燈標探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使熒光和猝滅基團盡可能的靠近，解決背景熒光高的問題，同時將探針臂也做為序列識別位點，使探針與靶序列結(jié)合更加緊密，提高雜交的效率[27]。

此外，我們引入了同源加尾系統(tǒng)(HAND)解決擴增過程中引物二聚體的問題，其原理是：在PCR的初始階段由于引物較高的溶解溫度(Tm值)低濃度的加尾引物特異的與靶序列結(jié)合，擴增并富集兩頭帶有Tag的PCR產(chǎn)物，若此時有引物二聚體形成，加尾引物兩頭的互補序列會構(gòu)成一個穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，致使其不能進行擴增，從而極大地減少了引物二聚體對熒光定量PCR的干擾[28]。蘭全學(xué)等[29]基于同源加尾體系建立快速診斷食品中沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌的多重?zé)晒釶CR檢測體系，臨床樣本檢測顯示該方法特異且敏感性高，該方法與國家標準方法對樣品的檢測結(jié)果一致。

本次研究中改良多重PCR體系對流感病毒檢出的陽性例數(shù)要低于參比試劑盒，存在假陰性的結(jié)果，可能是多重PCR體系中引物、模板的競爭性抑制導(dǎo)致體系的檢測最低限高于參比試劑盒，統(tǒng)計學(xué)分析顯示2種方法檢測甲型流感病毒和乙型流感病毒陽性檢出率均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.20，P=0.65和χ2=0.07，P=0.80)。結(jié)果表明雙重、三重甚至多重?zé)晒舛縋CR體系中的干擾因素要多于單重?zé)晒舛縋CR檢測體系，多重?zé)晒舛縋CR需要綜合多重擴增體系，勢必會犧牲一些檢出靈敏度。對改良多重PCR體系進行性能評估，其檢測甲型流感和乙型流感敏感性分別為97.5%和87.5%，特異性均為100%，一致性分析顯示兩種檢測方法檢測甲型流感病毒和乙型流感病毒均具有高度的一致性(Kappa=0.97，P=0.02和Kappa=0.93，P=0.07)。后續(xù)的研究還需要對構(gòu)建的體系進行的優(yōu)化，同時應(yīng)擴大樣本量，選擇三種及以上相關(guān)的商業(yè)化檢測試劑盒進一步的評估多重?zé)晒舛縋CR體系。

綜上所述，構(gòu)建的多重?zé)晒舛縋CR體系與達安流感病毒檢測試劑盒相比有較高的一致性，可用于快速、高通量篩查流感病毒感染人群，為流感的有效防控提供高效、可靠及精確的技術(shù)方法。