多糖作為免疫佐劑的研究進(jìn)展①

姜紅蕾 王鳳山（山東大學(xué)藥學(xué)院生化與生物技術(shù)藥物研究所，濟(jì)南 250012）

接種疫苗是產(chǎn)生充分的保護(hù)性免疫反應(yīng)來預(yù)防和控制傳染病傳播的最有效策略。疫苗需要有強(qiáng)的免疫原性才能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但單純由抗原組成的疫苗往往因其免疫原性弱而無法起到預(yù)防感染性疾病的作用，因此需要佐劑（adjuvant）來增強(qiáng)免疫反應(yīng)。目前，鋁佐劑是FDA 唯一批準(zhǔn)用于人體的佐劑，雖然已經(jīng)使用了80 余年，卻只能誘導(dǎo)Th2 型免疫反應(yīng)［1］。歐洲批準(zhǔn)使用的MF59（水包油型乳劑）可同時(shí)引起Th1 和Th2 型免疫應(yīng)答，但其會(huì)在注射部位引起不良反應(yīng)［2］。因此，開發(fā)新型的佐劑以克服現(xiàn)有佐劑的不足具有重要意義。許多多糖具有促進(jìn)機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫的作用，且具有低毒、安全等特點(diǎn)，可能成為理想的疫苗佐劑。本文綜述了殼聚糖、菊糖、葡聚糖、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、中藥多糖等作為免疫佐劑的研究，并對其作為佐劑的前景進(jìn)行了展望。

1 殼聚糖

殼聚糖（chitosan）是由幾丁質(zhì)N-脫乙?；纬傻奶烊欢嗑厶?。在酸性介質(zhì)中，殼聚糖分子上的氨基以-NH3+的形式存在，是唯一一種陽離子多糖，這一特性使殼聚糖能夠被制成微顆粒、納米顆粒等劑型［3］。殼聚糖作為免疫佐劑的特性由NISHIMURA 等［4］在1984年首次報(bào)道。在之后的30多年間，對殼聚糖進(jìn)行了大量研究。殼聚糖可通過TLR4 促進(jìn)樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC），能上調(diào)CD80 和CD86 表達(dá)，但未能激活T 細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子［5］，這表明單純殼聚糖不能引起T細(xì)胞相關(guān)免疫反應(yīng)。而殼聚糖及其衍生物與抗原結(jié)合后，可彌補(bǔ)殼聚糖本身的免疫缺陷。研究表明殼聚糖包裹卵清蛋白（OVA）的納米顆粒后可刺激主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子的表達(dá)，顯著上調(diào)共刺激因子CD40、CD80、CD86 的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞因子IL-6、IL-12、MIP-1、TNF-α 的分泌，并刺激CD4+和CD8+T 細(xì)胞的增殖［6-7］。殼聚糖顆粒已被證實(shí)可激活NLRP3 炎癥小體，該途徑可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集和抗原提呈細(xì)胞（APC）的成熟，并可產(chǎn)生以IL-1β和IL-18 等細(xì)胞因子分泌為特征的炎癥環(huán)境［8］。也有研究表明，殼聚糖可通過參與cGAS-STING 途徑激活DC 并促進(jìn)Th1 反應(yīng)［9］。這表明殼聚糖能夠通過多個(gè)途徑刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

近年來，殼聚糖在黏膜疫苗佐劑中也展現(xiàn)出了獨(dú)特應(yīng)用前景。殼聚糖由于其獨(dú)特的陽離子特性，具良好的黏膜黏附性，能延長抗原的滯留時(shí)間，并且能打開黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接，使抗原被黏膜APC 識別引起一系列免疫應(yīng)答［10］。將EV71 腸病毒的衣殼蛋白VP1 與殼聚糖混合，通過灌胃免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生大量IgG 抗體，誘導(dǎo)脾細(xì)胞產(chǎn)生高水平的Th1、Th2 和Th3 免疫反應(yīng)，且在小腸道、陰道、糞便、呼吸道中檢測出大量的VP1 特異性IgA 抗體，說明VP1 與殼聚糖混合給藥后可引起小鼠黏膜免疫應(yīng)答［11］。將O-季銨化殼聚糖和硫酸化可德蘭多糖制備形成納米顆粒荷載OVA 抗原，對小鼠滴鼻給藥后，在其口腔和陰道黏膜部位中也均發(fā)現(xiàn)了OVA特異性IgA 的表達(dá)［12］。由殼聚糖（ChiSysTM）、單磷酰脂質(zhì)（MPL）和諾如病毒VLP抗原制成的粉末噴霧疫苗（NV-VLP）已進(jìn)行了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，其結(jié)果表明，在人體中NV-VLP 具有良好的耐受性，無嚴(yán)重不良反應(yīng)，并引起腸黏膜組織（諾如病毒的進(jìn)入部位）分泌IgA［13］。

2 菊糖

菊糖（inulin），又名菊粉，是一種的天然果糖聚合物，是植物體內(nèi)的一種貯存多糖。菊糖主要存在α、β、γ、δ 4 種構(gòu)型。其中α、β 構(gòu)型在常溫下溶解，而γ 構(gòu)型菊糖要達(dá)到37℃溶解。δ 菊糖需要在40℃下才能溶解，但當(dāng)其開始冷卻后需要反復(fù)加熱處理才可以重新轉(zhuǎn)化為δ-菊糖。在1946 年科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)了可溶的菊糖，這些溶解性的菊糖不能激活補(bǔ)體或增強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，表明菊糖的免疫作用與其顆粒的特定包裝結(jié)構(gòu)密切相關(guān)［14］。菊糖的γ 和δ 構(gòu)型都具有免疫佐劑性質(zhì)。其中，γ-菊糖能夠使巨噬細(xì)胞表面的C3 片段沉積，從而導(dǎo)致T 細(xì)胞活化，但γ-菊糖在消毒時(shí)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不穩(wěn)定［15］。而δ 構(gòu)型具有很好的溫度穩(wěn)定性，其在伽馬射線滅菌后結(jié)構(gòu)無變化，還具有很好的免疫活性。目前δ-菊糖主要被制備成AdvaxTM作為免疫佐劑使用，AdvaxTM是由直徑1～2μm的層狀晶體圓形δ-菊糖微粒，這種特殊的微粒結(jié)構(gòu)是AdvaxTM激活免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵［16］。在研究中，證實(shí)了AdvaxTM對乙型肝炎病毒（HBV）、日本腦炎病毒、SARS 冠狀病毒、艾滋病毒（HIV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、李斯特菌、炭疽桿菌等多種病原微生物有免疫佐劑作用。早期研究中，用AdvaxTM和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）聯(lián)合免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，HBsAg 特異性抗體滴度升高，能促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖和Th1、Th2 和Th17 細(xì)胞因子產(chǎn)生［17］。與明礬組相比用，AdvaxTM至少可節(jié)省4 倍的抗原劑量。AdvaxTM用于流感疫苗中也能使免疫細(xì)胞增殖，使特異性抗體提高，且效果持久，在免疫后1年免疫作用仍然十分明顯。由AdvaxTM為佐劑制成的乙肝疫苗和流感疫苗已經(jīng)完成臨床Ⅰ期試驗(yàn)，其結(jié)果表明AdvaxTM具有良好的耐受性，未發(fā)現(xiàn)安全性問題［18-19］。除了可以用于傳統(tǒng)的免疫方式，AdvaxTM也可通過黏膜給藥。TOMAR 等［20］將AdvaxTM與滅活流感病毒混合制成噴霧劑，通過鼻內(nèi)免疫后與未加佐劑組相比，能夠引起更高的全身、黏膜和細(xì)胞免疫應(yīng)答。肺內(nèi)免疫時(shí)，AdvaxTM可增加肺內(nèi)因子CXCR3、CD69 和CD103 的表達(dá)。因此，AdvaxTM是一種很好的潛在黏膜佐劑。

目前，盡管對AdvaxTM有大量研究，但AdvaxTM的免疫機(jī)制尚不明確。推測其主要作用機(jī)制是先激活A(yù)PC，與抗原結(jié)合，誘導(dǎo)與增強(qiáng)抗原呈遞和抗原特異性相關(guān)的表型變化，包括使CD4+和CD8+T 細(xì)胞增殖，以及抗原刺激的IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17 和GM-CSF 的表達(dá)上調(diào)。并且，不同于傳統(tǒng)的佐劑明礬，AdvaxTM沒有強(qiáng)烈的Th2 或Th1 偏倚。同時(shí)，AdvaxTM佐劑不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1，不會(huì)誘導(dǎo)炎癥小體活化［17］。其佐劑作用不依賴于抗原吸收，因?yàn)榧词乖诳乖庖咔? d注射AdvaxTM，抗體反應(yīng)也會(huì)增強(qiáng)。

3 葡聚糖

葡聚糖可分為α-葡聚糖和β-葡聚糖。大多數(shù)葡聚糖來源于植物或微生物，種類繁多。具有佐劑活性的α-葡聚糖主要有右旋糖酐，β-葡聚糖主要有海帶多糖、香菇多糖、酵母聚糖等。

3.1 α-葡聚糖 右旋糖酐（dextran）是由多個(gè)葡萄糖縮合而成的同聚多糖。右旋糖酐硫酸化后具有廣泛的促炎作用，是一種有效的引起細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的免疫佐劑［21］。二乙基氨基乙基（DEAE）-葡聚糖是右旋糖酐的衍生物，已被用作獸用佐劑。在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，乙酰化葡聚糖（Ac-DEX）微?？烧{(diào)節(jié)疫苗的釋放和抗原的遞送。CHEN 等［22］將Ac-DEX 微粒和OVA 共同免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，Ac-DEX 微粒作為佐劑可以誘導(dǎo)更強(qiáng)的IgG、IgG1 和IgG2a 水平，這可能是由于增強(qiáng)了細(xì)胞攝取和促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)的通路。此外，與鋁佐劑組相比，Ac-DEX 微粒產(chǎn)生了更平衡的Th1/Th2 應(yīng)答。研究還表明，Ac-DEX 微?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)抗原的釋放從而改變到達(dá)最強(qiáng)免疫的時(shí)間。這為生產(chǎn)更加安全有效的疫苗佐劑提供了研究基礎(chǔ)。

3.2 β-葡聚糖 β-葡聚糖主要來源于生物的細(xì)胞壁，如酵母、某些種類的海藻等。在研究中，β-葡聚糖沒有明顯的毒性或副作用。由于不同種類β-葡聚糖結(jié)構(gòu)的差異，其免疫作用也存在差異。總的來說，β-葡聚糖可作為病原相關(guān)分子模式（PAMP）被免疫細(xì)胞表面的Toll 樣受體、dectin-1、CR3 和CD5受體識別。β-葡聚糖和受體間的相互作用觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號激活免疫相關(guān)分子的表達(dá)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。從釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）細(xì)胞壁上獲得的β-葡聚糖能激活巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、DC，導(dǎo)致炎癥，刺激分泌TNF-α、IL-8、活性氧自由基（ROS）和花生四烯酸等炎癥因子［23］。有研究發(fā)現(xiàn)，dectin-1受體的激活同時(shí)活化了Toll樣受體介導(dǎo)的NF-κB，dectin-1受體和Toll樣受體協(xié)同介導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生［24］。還有研究表明，蘑菇多糖可降低OVA 誘導(dǎo)的Th2 免疫應(yīng)答，增強(qiáng)Th1型免疫應(yīng)答，從而表明其不僅能夠激活固有免疫應(yīng)答，也能激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答［25］。將葡聚糖制備成微粒后作為抗原載體也能引起強(qiáng)免疫反應(yīng)。DEEPE 等［26］用葡聚糖微粒包裹莢膜組織胞漿菌的堿性提取物鼻腔免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)肺和脾臟的菌落數(shù)明顯下降，且肺內(nèi)的IFN-γ、IL-17 分泌增加，引起Th1 和Th17 T 細(xì)胞免疫應(yīng)答。為了引起更加強(qiáng)烈和平衡的免疫應(yīng)答，LIU 等［27］通過添加其他類型佐劑制成微粒來增強(qiáng)葡聚糖的佐劑性，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方向。近年來，進(jìn)行了葡聚糖通過黏膜給藥途徑進(jìn)行免疫的研究。例如，小鼠口服β-葡聚糖后，腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞因子IFN-γ 分泌增加，迅速引起黏膜部位產(chǎn)生T細(xì)胞免疫應(yīng)答［28］。在接觸病原的早期，使黏膜部位快速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，防止組織感染的發(fā)生。

4 LPS

LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的一部分，一般占外膜的35%～45%。毫無疑問，LPS 是天然免疫的誘導(dǎo)劑和增強(qiáng)劑。傳統(tǒng)上，一般認(rèn)為LPS 能夠被細(xì)胞上TLR4 識 別，激 活MyD88（myeloid differentiation primary response gene 88）和TIR（Toll/IL-1 receptor）通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化和炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，使T細(xì)胞的反應(yīng)向Th1 轉(zhuǎn)移［29-30］。最近，有研究發(fā)現(xiàn)LPS可觸發(fā)caspase-11 介導(dǎo)的非典型炎癥小體［30-31］。而LPS無法作為人類佐劑使用主要是由于其能強(qiáng)烈激活MyD88 通路，導(dǎo)致不必要的、潛在有害的炎癥反應(yīng)。從20世紀(jì)70年代開始，對LPS進(jìn)行了大量的改造實(shí)驗(yàn)，并成功制備了毒性更低，免疫作用強(qiáng)的單磷酰脂質(zhì)A（monophosphoryl lipid A，MPLA）。根據(jù)臨床研究，MPLA 是一種安全的佐劑［32-33］。MPLA 是70 多年來第1 個(gè)被批準(zhǔn)作為佐劑使用的TLR 激動(dòng)劑，也是第1個(gè)用于人類的新佐劑。MPLA在保留免疫刺激活性的同時(shí)降低毒性的主要原因之一是MyD88 減少信號而TRIF（toll-interleukin 1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-beta）途徑保留信號［34］。與MyD88 相比，TRIF 途徑在允許TLR4 激動(dòng)劑介導(dǎo)的早期T 細(xì)胞反應(yīng)的刺激方面發(fā)揮更顯著的作用。目前，由葛蘭素史瑞克公司研制的AS01、AS02、AS04佐劑中都含有MPLA，已被批準(zhǔn)用于瘧疾疫苗、乙肝病毒疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗等多種疫苗中。表1為幾種研究較多的多糖免疫作用及其作為佐劑的研究現(xiàn)狀。

表1 多糖的免疫作用及其研究現(xiàn)狀Tab.1 Immunity and research status of polysaccharides

5 中藥多糖

除了以上所述的幾類多糖以外，中藥多糖也具有發(fā)展為佐劑的潛能。由于中藥來源和種類廣泛，中藥多糖的種類也很繁多，每種中藥多糖具有獨(dú)特的免疫作用。總的來說，中藥多糖可增強(qiáng)細(xì)胞因子的表達(dá)、CD4+和CD8+T 細(xì)胞的活化以及NK 細(xì)胞的活性，從而產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用并促進(jìn)人體的體液免疫功能?？茖W(xué)家們對黃芪多糖、當(dāng)歸多糖、枸杞多糖、茯苓多糖、牛膝多糖、板藍(lán)根多糖等的佐劑作用進(jìn)行了大量研究，免疫效果也各有不同。黃芪多糖增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，激活T 細(xì)胞和B 細(xì)胞，并能促進(jìn)抗體形成，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，并且可以增強(qiáng)遞呈口蹄疫病毒、禽流感病毒、乙肝病毒等多種抗原的免疫原性［36-37］。當(dāng)歸多糖作為新城疫病毒疫苗佐劑可提高血凝反應(yīng)，在免疫后期提高抗體滴度［38］。枸杞多糖能顯著增強(qiáng)機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)功能［39］。枸杞多糖脂質(zhì)體可誘導(dǎo)DCs 的成熟，誘導(dǎo)其活化，促進(jìn)抗原特異性體液免疫應(yīng)答，導(dǎo)致Th1 和Th2 細(xì)胞因子水平升高。枸杞多糖脂質(zhì)體還可促進(jìn)TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB 基因表達(dá)［40］。茯苓多糖作為流感疫苗佐劑免疫效果強(qiáng)烈。在攻毒實(shí)驗(yàn)中，茯苓多糖能提高小鼠流感病毒的致死劑量，提高了滅活流感疫苗的免疫效果［41］。多種中藥多糖可以合理配伍制備成復(fù)合成多糖佐劑配方（CPS），從而引起更加廣泛且強(qiáng)大的免疫應(yīng)答。何云富等［42］以對豬O 型口蹄疫病毒（FMDV）滅活抗原具有佐劑效應(yīng)的黃芪多糖、人參多糖、木蟞子多糖、茯苓多糖和云芝多糖5 種多糖為佐劑成分制備成CPS，免疫后雖然CPS 不能刺激抗體分泌，但能顯著提高血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ 的分泌，進(jìn)一步擴(kuò)大Th1應(yīng)答效應(yīng)，使機(jī)體發(fā)揮更有力的細(xì)胞免疫。

6 總結(jié)

作為佐劑，多糖無毒且副作用少。由于分子量相對較大、能與免疫細(xì)胞表面受體識別結(jié)合等特點(diǎn)，易作為抗原被多種免疫細(xì)胞識別，從而激發(fā)多種免疫機(jī)制。許多多糖還能夠引起黏膜免疫應(yīng)答，這為通過黏膜部位感染機(jī)體病原體疫苗的研究提供了新的策略和思路。多糖與其他免疫佐劑制成復(fù)合佐劑產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)從而引發(fā)更加強(qiáng)烈全面免疫效果，也已逐步成為熱點(diǎn)研究方向。由于多糖本身的多樣化，每種多糖引起的免疫應(yīng)答的機(jī)制并不清晰，需要進(jìn)一步探索。且其生產(chǎn)質(zhì)量控制也面臨巨大挑戰(zhàn)，需要制定更加詳細(xì)嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。這些將成為促進(jìn)多糖疫苗佐劑的臨床開發(fā)和商品化進(jìn)程的關(guān)鍵。