IL-4 rs2243250和IL-4R rs1805010基因多態(tài)性和復發(fā)性流產(chǎn)的相關性①

劉 倩 李亞梅 陳麗娜 李 靜 裴建贏 王燕俠 毛寶宏（甘肅省婦幼保健院科研中心，蘭州 730050）

復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是一種常見的妊娠并發(fā)癥，其病因復雜，年齡、生活方式、遺傳、內(nèi)分泌、解剖和免疫等多種因素均與其發(fā)病有關［1］。研究發(fā)現(xiàn)促炎和抗炎細胞因子之間的生理平衡對胚胎著床和維持妊娠至關重要［2］。促炎細胞因子包括Th1 型細胞因子（如IFN-γ 和TNF-α）和其他細胞因子（如IL-1β和IL-6），而抗炎細胞因子是Th2 型的細胞因子（如IL-4 和IL-10）和其他細胞因子（如TGF-β1）［3］。IL-4可促進Th細胞分化為Th2效應細胞，并通過與其受體IL-4Ra 結合激活信號通路來發(fā)揮抗炎作用［4］。既往研究關于IL-4基因多態(tài)性和RSA 的相關性結果并不一致［5-6］，且IL-4R 基因多態(tài)性和RSA 的相關性研究尚未見報道，為進一步明確這兩個基因多態(tài)性與RSA 的關系，本研究應用SNaPshot 技術對IL-4 rs2243250 和IL-4R rs1805010基因多態(tài)性進行分型，評估其對RSA 發(fā)病的影響，以期為臨床診斷RSA提供早期分子標志物。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 患者信 息 RSA 組：選取2019 年1 月至2020 年8 月就診于甘肅省婦幼保健院RSA 門診的至少有過3 次流產(chǎn)的婦女150 例作為RSA 組，RSA的診斷根據(jù)2016年我國“復發(fā)性流產(chǎn)診治的專家共識”標準［7］。診斷和排除標準：①妊娠28 周前發(fā)生自然流產(chǎn)至少3 次；②夫婦雙方不存在異常染色體核型；③無生殖器解剖學畸形；④內(nèi)分泌功能正常；⑤無血栓前狀態(tài)、低纖維蛋白血癥及血小板增多癥；⑥ACA、β2 球蛋白、抗甲狀腺抗體等自身抗體陰性；⑦排除乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒等傳染性疾病；⑧排除宮外孕、生化妊娠、計劃流產(chǎn)、意外流產(chǎn)等妊娠史。健康對照組：選取與RSA 組同一時段于甘肅省婦幼保健院健康管理中心進行體檢的女性健康志愿者150 例作為對照組。診斷和排除標準：①既往無自然流產(chǎn)、宮內(nèi)生長遲緩及胎兒先天缺陷等不良孕產(chǎn)史；②至少有過1次正常生育史；③排除高血壓、糖尿病、肝腎、內(nèi)分泌、免疫異常等全身性或基礎性疾病。所有研究對象均閱讀并簽署知情同意書。本課題經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會批準，并符合《赫爾辛基宣言》。

1.1.2 試劑與儀器 人類基因組DNA 提取試劑盒（中國北京天根生化科技有限公司）；GC-Ⅰbuffer（TaKaRa）；HotStarTaq polymerase（Qiagen Inc.）；蝦堿酶（Promega）；外切酶Ⅰ（Epicentre）；SNaPshot Multiplex Kit（ABI）；FR-110 紫外分析儀、FR-250 電泳儀（上海復日科技有限公司）；凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）；2720 Thermal Cycler 擴增儀、3730xl genetic analyzer分析儀（美國ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有研究對象空腹12 h 后于次日清晨采集外周血3 ml于EDTA-K2抗凝管并分裝凍存于-80℃冰箱。同時收集并記錄患者的年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、焦慮自評量表（self-rating anxiety scale，SAS）和抑郁自評量表（selfrating depression scale，SDS）評分等一般資料。

1.2.2 DNA 提取 取出之前分裝保存的EDTA 抗凝劑全血，全基因組DNA 的提取根據(jù)DNA 提取試劑盒說明書進行。使用分光光度計檢測提取DNA的濃度和純度，DNA 濃度＞20 ng/μl，A260/A280≈1.8，A260/A230＞2.0，則DNA 提取成功，可以繼續(xù)進行下一步實驗。

1.2.3 基因分型 本實驗利用SNaPshot SNP 分型技術進行分型。引物用在線Primer3 軟件設計（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/），并由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及長度見表1。采用20 μl PCR 擴增體系：去離子水5 μl，2×GC-Ⅰbuffer 10μl，3.0 mmol/L Mg2+0.4μl，0.3 mmol/L dNTP 2.4 μl，1 U HotStarTaq polymerase 0.2 μl，樣本DNA 1μl 和多重PCR 引物1μl。擴增程序如下：95℃2 min；94℃20 s，65℃（-0.5℃/循環(huán)）40 s，72℃1.5 min，11 個循環(huán)；94℃20 s，59℃30 s，72℃2 min，24個循環(huán)；72℃2 min。將5 U蝦堿酶和2 U外切酶Ⅰ加入10 μl PCR 產(chǎn)物中，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min 進行純化。之后進行SNaPshot 多重單堿基延伸反應，體系（10 μl）包括5 μl SNaPshot Multiplex Kit，2 μl 純化后的多重PCR 產(chǎn)物，1 μl 延伸引物混合物，2μl 超純水。程序如下：96℃1 min；96℃10 s，55℃5 s，60℃30 s，28 個循環(huán)。然后在10μl延伸產(chǎn)物中加入1 U 蝦堿酶，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min 進行純化。最后取0.5 μl 純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5 μl LIZ 120 Size Standard 和9 μl Hi-Di 混勻，95℃變性5 min后上3730XL測序儀進行測序，測序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1分析。

表1 IL-4 rs2243250 和IL-4R rs1805010 引物序列和PCR產(chǎn)物長度Tab.1 Primer sequences and length of PCR products of IL-4 rs2243250 and IL-4R rs1805010

1.3 統(tǒng)計學處理 對IL-4 rs2243250 和IL-4R rs1805010 位點基因型分布進行Hardy-Weinberg（HWE）平衡檢驗，P＞0.05 表示符合HWE 平衡檢驗。采用χ2檢驗進行組間基因型和基因頻率對比（顯著性水平α=0.05），基因型與RSA 的相關性采用優(yōu)勢比（odd ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（95%confidence interval，95%CI）表示，統(tǒng)計分析采用SPSS26.0軟件進行，Logistic二元逐步回歸進行多因素分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RSA 組和正常對照組基本信息 RSA 組和正常對照組間年齡、BMI、民族、吸煙史、飲酒史、SAS和SDS 積分比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組間的居住地和家庭收入比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 RSA組和對照組女性人口學和臨床特征Tab.2 Demographic and clinical characteristics of RSA group and control group

2.2 IL-4 基 因rs2243250 和IL-4R 基 因rs1805010在RSA 與對照人群基因多態(tài)性分析 對照組人群IL-4 基因rs2243250 和IL-4R 基因rs1805010 位點符合HWE 平衡分析（P均＞0.05）。RSA 組人群IL-4 基因rs2243250 位點TT 基因型分布頻率為58.7%，TC基因型為35.3%，CC 基因型為6.0%，對照組人群中rs2243250 位點TT 基因型分布頻率為60.0%，TC 基因型為35.3%，CC 基因型為4.7%。對IL-4 基因rs2243250 位點在RSA 和對照組人群中的基因型分布進行比較，結果顯示差異無統(tǒng)計學意義（P=0.87），見表3。

RSA 組人群IL-4R 基因rs1805010 位點GG 基因型分布頻率為34.7%，GA 基因型為42%，AA 基因型為23.3%，對照組人群中rs1805010 位點GG 基因型分布頻率為21.3%，GA 基因型為52%，AA 基因型為26.7%。對IL-4R 基因rs1805010 位點在RSA 和對照組人群中的基因型分布進行比較，結果顯示差異有統(tǒng)計學意義（P=0.04）。攜帶有GA 基因型的人群RSA 發(fā)病風險降低（OR=0.50，95%CI=0.29～0.86），經(jīng)校正年齡、BMI、民族、居住地等因素后，多因素回歸分析顯示攜帶有GA 基因型的人群RSA 發(fā)病風險仍降低（OR=0.55，95%CI=0.30～0.99），見表3。

表3 IL-4 rs2243250和IL-4R rs1805010基因多態(tài)性和RSA發(fā)病的相關性Tab.3 Association between IL-4 rs2243250 and IL-4R rs1805010 gene polymorphisms and risk of RSA

2.3 不同遺傳模式下IL-4 rs2243250 和IL-4R rs1805010 基因多態(tài)性和RSA 發(fā)病的相關性 在等位基因遺傳模式下，RSA 組和對照組IL-4R rs1805010 位點A 等位基因分布差異有統(tǒng)計學意義（P=0.041），攜帶有A 等位基因的人群RSA 發(fā)病風險低于G 等位基因（OR=0.71，95%CI=0.52～0.99），經(jīng)校正年齡、BMI、民族、居住地等因素后，多因素回歸分析顯示攜帶有A 等位基因的人群RSA 發(fā)病風險仍降低（OR=0.71，95%CI=0.51～0.99）。同時在顯性遺傳模式下，RSA 組和對照組IL-4R rs1805010位點AA+GA 基因型分布差異有統(tǒng)計學意義（P=0.01），攜帶有AA 和GA 基因型的人群RSA 發(fā)病風險低于GG 基因型（OR=0.51，95%CI=0.31～0.86），經(jīng)校正年齡、BMI、民族、居住地等因素后，多因素回歸分析顯示攜帶有AA 和GA 基因型的人群RSA 發(fā)病風險仍降低（OR=0.49，95%CI=0.29～0.85），見表4。

表4 不同遺傳模式下IL-4 rs2243250和IL-4R rs1805010基因多態(tài)性和RSA發(fā)病的相關性Tab.4 Association between IL-4 rs2243250 and IL-4R rs1805010 gene polymorphisms and risk of RSA under different inheritance models

3 討論

RSA 不僅會給孕婦和家庭造成極大的心理壓力和經(jīng)濟負擔，同時還會影響后期的妊娠結局。近年來免疫失調(diào)被認為是導致RSA 的潛在機制，正常妊娠過程傾向于Th2 型免疫反應，而有RSA 病史的女性傾向于Th1 型免疫反應［8］。Th1 型免疫反應是早期著床需要的，而妊娠的維持依賴于Th2 型抗炎細胞因子或Treg［9］。IL-4作為Th2型抗炎細胞因子，對Th1 型細胞因子發(fā)揮拮抗作用，可通過與其受體IL-4Ra 結合促進胚胎發(fā)育和胎盤形成，對妊娠成功起重要作用［10］。單核苷酸多態(tài)性可能通過改變基因的功能或轉(zhuǎn)錄活性從而影響蛋白的活性或表達，因此本研究探討IL-4 和IL-4R 基因多態(tài)性與RSA 發(fā)病間的相關性，以期為臨床從分子學水平診斷RSA提供參考。

本研究人口學和臨床資料統(tǒng)計顯示居住地和家庭月收入在RSA 和健康志愿者間差異有統(tǒng)計學意義。居住地對RSA 妊娠結局的影響可能主要與居住環(huán)境因素有關，有研究顯示，居住環(huán)境有噪音和難聞性氣味均是發(fā)生RSA 的獨立危險因素［11］。BRUCKNER 等［12］報道低收入女性群體相較于高收入群體其焦慮和抑郁程度更高，不良心理狀態(tài)可作用于神經(jīng)系統(tǒng)，使交感神經(jīng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸調(diào)節(jié)途徑異常，進而經(jīng)雙向調(diào)節(jié)影響機體的免疫功能［13］。關于居住地和家庭月收入對RSA 的影響還需進一步研究，同時本研究納入的環(huán)境和社會危險因素有限，應進一步加強RSA 風險因素篩查，并對風險因素提前進行預防和控制，從而提高RSA患者的妊娠成功率。

同時本研究顯示IL-4 rs2243250 基因多態(tài)性與RSA發(fā)病不相關，目前國內(nèi)關于IL-4 rs2243250多態(tài)性與RSA 相關性的文章尚未見報道，國外ESKANDAR團隊運用等位基因特異性寡核苷酸雜交法PCR（ASO-PCR）技術行基因分型，分析伊朗婦女人群IL-4 rs2243250多態(tài)性與RSA發(fā)病的相關性，結果顯示IL-4 rs2243250多態(tài)性與RSA 不相關［5］，與本研究一致。另外PARVEEN 等［6］運用同樣的ASO-PCR 技術對北印度婦女人群IL-4 rs2243250 多態(tài)性位點進行檢測分析，結果卻發(fā)現(xiàn)在顯性和等位基因模式下差異有統(tǒng)計學意義，T 等位基因和TT、TC 基因型是發(fā)生RSA 的危險因素。國外這兩個研究采用同種檢測技術進行基因分型，結果的差異可能主要由納入的人群種族不同所造成。

關于IL-4R rs1805010 基因多態(tài)性的研究，近年來主要集中在過敏性相關疾病，如哮喘和腎移植后急性排斥反應等，也見于宮頸上皮內(nèi)病變與宮頸癌［14-16］，但關于IL-4R rs1805010 基因多態(tài)性和RSA的相關性目前尚未見報道。本項目首次對IL-4R rs1805010 基因多態(tài)性和RSA 的相關性研究顯示，A等位基因和AA、GA 基因可能是發(fā)生RSA 的保護因素，臨床應重點關注攜帶IL-4R rs1805010 位點G 等位基因和GG 基因型的婦女，其RSA 發(fā)病風險相對增高。關于IL-4R rs1805010 基因多態(tài)性與RSA 的發(fā)病機制目前尚不清楚，IL-4R 是一種由兩個不同亞基組成的蛋白質(zhì)，即α鏈和γc 鏈。α鏈從IL-4 信號轉(zhuǎn)移而來，隨后被γc 鏈放大［17］。IL-4R rs1805010基因多態(tài)性位于α鏈的編碼區(qū)，研究表明，這種多態(tài)性變異可影響IL-4R 受體對IL-4 的敏感性增強，這種增強的IL-4 信號持續(xù)促進磷酸化，會使STAT6轉(zhuǎn)錄因子異常激活，導致Th2 細胞分化增加［18-19］。Th1/Th2 分化失衡可能會導致細胞因子分泌異常，進而在RSA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

本研究顯示環(huán)境因素居住地和家庭月收入是RSA 的風險因素，IL-4R rs1805010 位點A 等位基因和AA、GA 基因型可能是RSA 發(fā)病的保護因素，IL-4 rs2243250 基因多態(tài)性與RSA 無相關性。IL-4 及其受體IL-4R 與RSA 相互作用機制及環(huán)境因素和基因的交互作用還有待進一步研究。