CCL15在膿毒癥免疫病理過程中的作用及機制研究①

黃麗莉 李佳熹 黃 俊 余仁琳 曹 炬（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，重慶 400016）

根據(jù)膿毒癥3.0 的定義，膿毒癥是由于宿主對感染反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙［1］。膿毒癥對人們的生命健康造成極大威脅，雖然近年來膿毒癥在診斷及治療方面都取得了明顯進展，但迄今為止，它仍是ICU死亡的主要原因。當膿毒癥伴隨休克發(fā)生時，病死率可以達到40%～50%［2］。膿毒癥發(fā)病機制尚未明了，且無較好治療方案和診斷標志物［3］。膿毒癥主要由機體免疫功能紊亂所致，在此過程中有大量細胞因子參與，促炎因子大量釋放的同時伴有抑炎因子的合成與釋放，與后期發(fā)展成免疫失衡密切相關(guān)［4］。因此，探尋細胞因子在膿毒癥中的調(diào)控作用有助于明確膿毒癥發(fā)生機制。CCL15（CC motif chemokine ligand 15）是一種重要的趨化因子，通過與CCR1和CCR3結(jié)合對免疫細胞發(fā)揮生物學(xué)活性，它對大多外周血白細胞亞群都有強吸引力［5］。有研究報道CCL15參與慢性肺炎、結(jié)直腸癌的疾病進程，體現(xiàn)了CCL15 在癌癥轉(zhuǎn)移和炎癥反應(yīng)中的作用，但關(guān)于CCL15 在膿毒癥中的作用尚不清楚［6-7］。本研究發(fā)現(xiàn)CCL15 在膿毒癥患者中的表達水平顯著升高，表明CCL15 參與膿毒癥的疾病進程，進一步探究其參與膿毒癥免疫調(diào)控的機制，有望為膿毒癥的診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用6～8 周雄性C57BL/6 小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司（合格證號：110322220100267963），飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)SPF 級實驗動物中心，所有動物實驗操作嚴格遵守動物中心的要求，并經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會論證通過。

1.1.2 實驗材料、試劑 根據(jù)膿毒癥3.0 的定義，納入重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的30 例膿毒癥成人患者以及重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心收治30 例年齡和性別匹配的健康成人對照樣本。記錄患者及健康對照者的臨床資料，包括序貫器官衰竭評估（SOFA）評分、白細胞（WBC）計數(shù)、降鈣素原（PCT）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、血小板（PLT）水平、年齡等（表1）。惡性腫瘤患者、器官移植患者、艾滋病毒感染者和在過去8周內(nèi)接受免疫抑制治療的患者被排除在研究之外。本方案經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)臨床研究倫理委員會批準。

表1 膿毒癥患者及健康對照者臨床資料Tab.1 Baseline characteristics of patients with sepsis and healthy controls

哥倫比亞血瓊脂平板購自安圖生物；ELISA 試劑盒購自Sigma 公司，人重組CCL15 蛋白（recombinant human CCL15 protein）購自R&D Systems；Alexa 647 標記的CD11b 抗體、PE 標記的F4/80 抗體及同型對照抗體購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立與分組 將小鼠隨機分為3 組，每組10 只，即假手術(shù)組（Sham）、對照組（CLP+PBS）、蛋白組（CLP+CCL15）。采用盲腸結(jié)扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）模型建立膿毒癥的動物模型［8］。在CLP 模型中，通過對小鼠進行盲腸結(jié)扎穿刺，造成內(nèi)源性腹部感染，隨后細菌進入血液腔室，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)。麻醉小鼠并暴露盲腸，用縫合線進行結(jié)扎，再用穿刺針刺穿盲腸，隨后對腹部切口進行縫合。Sham 組小鼠接受麻醉，暴露盲腸，但不進行結(jié)扎或穿刺，隨后將盲腸放回腹膜腔。在補充重組蛋白時，小鼠CLP 術(shù)后立即注射人CCL15重組蛋白，對照組小鼠進行同樣操作，并注射等量含0.1%BSA的PBS。

1.2.2 ELISA 檢測血清CCL15 水平 取膿毒癥患者、健康體檢者外周血，離心后取血清凍存于-80℃冰箱中。取膿毒癥小鼠或?qū)φ战M小鼠心臟血，離心后取血清凍存于-80℃。實驗步驟嚴格按照ELISA試劑說明書進行。

1.2.3 血液生化 心臟穿刺后用肝素抗凝EP管收集小鼠血液，離心后取上清。檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）、和肌酐（CREA）等指標。

1.2.4 細菌載量試驗 在CLP 后的24 h 處理小鼠，在無菌條件下收集心臟血。梯度稀釋10 倍及100 倍，無菌涂布于血瓊脂平板，37℃孵育過夜，計菌落數(shù)量。

1.2.5 組織病理 取小鼠肺臟、肝臟，浸泡于4%多聚甲醛中，4℃固定24～48 h。之后依次進行洗滌、脫水、透明、浸蠟，然后進行包埋和切片。將石蠟切片于二甲苯中脫蠟，于梯度濃度的乙醇中進行水化。蘇木精染色后，用自來水沖洗后在1%鹽酸乙醇中分化10 s。在飽和碳酸鋰溶液中處理后在蒸餾水中靜置數(shù)分鐘，用伊紅染色2 min。漂洗后用梯度乙醇脫水2 min，轉(zhuǎn)移入二甲苯中透明處理10 min，最后用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。

1.2.6 腹腔灌洗液（peritoneal lavage fluide，PLF）總白細胞計數(shù) 取小鼠PLF，4℃離心后棄上清。加入500μl紅細胞裂解液重懸細胞沉淀，裂解3 min后再次離心棄去上清。加入1 ml PBS 再次重懸細胞沉淀，用牛鮑計數(shù)板計數(shù)總白細胞數(shù)，剩余細胞可用于流式檢測。

1.2.7 流式抗體染色 取PLF 細胞沉淀加入紅細胞裂解液裂解3 min，離心后去上清。用已預(yù)冷處理的無菌PBS 洗滌2 次。向每管內(nèi)加入2 μl CD16/32抗體，充分混勻后轉(zhuǎn)移至4℃冰箱內(nèi)，避光封閉15 min。分別向EP 管內(nèi)加入1μl 待染色細胞的特異性熒光標記抗體（Alexa 647-CD11b、PE-F4/80）或者其同型對照抗體，4℃避光孵育30 min。用PBS洗滌細胞后進行離心重懸，送檢。

1.2.8 細菌吞噬和殺傷試驗 小鼠腹腔注射液體石蠟，以募集巨噬細胞。5～7 d 后將小鼠斷頸，于無菌環(huán)境下抽取腹腔灌洗液，獲得原代腹腔巨噬細胞，待細胞穩(wěn)定之后分別加入蛋白或者PBS 刺激過夜。以MOI 100 加入銅綠假單胞菌在37℃下感染巨噬細胞30 min，用含有妥布霉素的緩沖液去除胞外細菌。加入200μl 無菌雙蒸水，室溫裂解細胞約20 min以評估吞噬能力（t=0 h），或孵育2 h（t=2 h）以評估細菌殺傷能力。將稀釋后的裂解液均勻鋪于血平板，置于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)16～20 h，計數(shù)菌落數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和作圖均使用GraphPad Prism 5.01 軟件進行。采用Mann-WhitneyU檢驗分析組間差異；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線并采用對數(shù)秩檢驗進行生存曲線分析，比較生存率差異。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗均重復(fù)2次。

2 結(jié)果

2.1 CCL15 在膿毒癥患者和膿毒癥小鼠中表達升高 ELISA 檢測膿毒癥患者和健康體檢者血清CCL15 的含量，膿毒患者血清中CCL15 表達明顯高于健康對照組（P＜0.000 1，圖1A）。隨后血清濃度下降，但仍然顯著高于對照組（P＜0.000 1，圖1B）。通過CLP 建立小鼠膿毒癥模型，取小鼠心臟血，ELISA 檢測CCL15 水平。結(jié)果顯示，膿毒癥小鼠CCL15水平較Sham組小鼠顯著升高（P＜0.01，圖1C）。

圖1 膿毒癥患者和膿毒癥小鼠ELISA檢測結(jié)果Fig.1 ELISA results of septic patients and septic mice

2.2 CCL15 顯著改善膿毒癥小鼠生存率 在實驗動物模型中，通過注射人CCL15 重組蛋白，進一步探究CCL15 在膿毒癥中的作用。其中，實驗組和CLP+PBS 組小鼠均通過CLP 方法構(gòu)建膿毒癥的動物模型，并分別注射CCL15 重組蛋白（0.5μg/只）和含0.1%BSA 的PBS。Sham 組對小鼠進行腹腔的剪開、縫合。在建模后14 d 內(nèi)每天觀察小鼠的生存情況。觀察發(fā)現(xiàn)，在補充CCL15 重組蛋白之后，膿毒癥小鼠的生存率較CLP+PBS 顯著提高（P＜0.01，圖2）。結(jié)果表明，CCL15可以改善膿毒癥生存率。

圖2 補充重組CCL15蛋白改善膿毒癥小鼠生存率Fig.2 Supplementation with recombinant CCL15 protein improved survival rate of sepsis mice

2.3 CCL15 改善膿毒癥小鼠病理損傷 膿毒癥往往導(dǎo)致多器官損傷，進一步研究了CCL15 對于膿毒癥小鼠器官損傷的影響。生化結(jié)果顯示，蛋白處理組ALT、LDH、CREA 等生化損傷相關(guān)指標較PBS 處理組顯著降低（P＜0.05，圖3）。HE 染色也顯示CCL15處理改善了膿毒癥小鼠的器官損傷情況。對照組小鼠的肝組織中局部可見較大量的肝細胞壞死，核碎裂或溶解，局部可見肝細胞水腫（圖4A）；肺組織中較多肺泡壁增厚，伴有較多淋巴細胞與中性粒細胞浸潤（圖4B）。CCL15 處理組的炎癥浸潤、充血水腫均有改善。

圖3 CCL15對膿毒癥小鼠生化指標的影響Fig.3 Effects of CCL15 on biochemical indexes of septic mice

圖4 CCL15 對膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠組織病理學(xué)改變的影響（×200）Fig.4 Effects of CCL15 to histopathological changes in septic mice（×200）

2.4 CCL15 處理促進膿毒癥小鼠細菌清除 膿毒癥與感染密切相關(guān)，為進一步探索CCL15 對于膿毒癥小鼠體內(nèi)細菌清除的影響，于CLP 術(shù)后24 h 取小鼠心臟血進行細菌載量實驗。相較于CLP+PBS 組，CLP+CCL15 組的小鼠血液中的細菌載量顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖5）。

圖5 細菌載量Fig.5 Bacterial counts

2.5 CCL15處理促進小鼠PLF免疫細胞聚集 CLP建模后24 h 的膿毒癥小鼠腹腔灌洗液，計細胞總數(shù)，通過流式細胞術(shù)染色計數(shù)巨噬細胞（CD11b+F4/80+）百分比。經(jīng)重組CCL15 蛋白處理后，膿毒癥小鼠PLF 中白細胞總數(shù)較PBS 處理的CLP+PBS 組顯著增加（P＜0.05，圖6），提示白細胞募集顯著增多。相較于CLP+PBS 組，CLP+CCL15 組小鼠PLF 中巨噬細胞比例增加，巨噬細胞數(shù)量顯著增多（P＜0.05，圖6）。

圖6 CLP術(shù)后小鼠PLF中白細胞浸潤情況Fig.6 Leukocytes recruitment in PLF after CLP

2.6 CCL15 處理對巨噬細胞吞噬殺傷的影響 進一步通過體外實驗探究CCL15 是否影響巨噬細胞抗菌功能。分別用重組人CCL15蛋白和PBS刺激巨噬細胞，再用銅綠假單胞菌感染巨噬細胞，結(jié)果顯示，經(jīng)CCL15 蛋白刺激后，巨噬細胞的吞噬殺傷能力高于PBS 對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖7）。

圖7 CCL15對巨噬細胞殺傷的影響Fig.7 Effects of CCL15 on bacterial phagocytosis and killing by macrophages

3 討論

膿毒癥在任何年齡、任何基礎(chǔ)疾病背景下均可發(fā)生，尤其是在并發(fā)膿毒癥休克后更加危險，病死率極高［9］。有研究報道，膿毒癥是重型及危重型新冠肺炎患者最常見的并發(fā)癥，重癥患者多在1 周后出現(xiàn)膿毒癥、膿毒性休克，膿毒癥在新冠肺炎非幸存組的發(fā)生率甚至達到100%［10-11］。膿毒癥目前仍缺乏有效的治療藥物和高效診斷標志物，對于膿毒癥的認識還需要更多的研究。CCL15 又名Lkn-1、HCC-2、NCC-3，其mRNA在肝、腸、肺中高度表達［12-13］。本研究首次闡明CCL15 在膿毒癥中表達量顯著增高，發(fā)揮免疫保護作用，改善膿毒癥小鼠生存情況。

過去的研究顯示，CCL15 表達在慢性過敏性肺炎、哮喘、肝癌等疾病中升高，體現(xiàn)了CCL15 在癌癥轉(zhuǎn)移和炎癥反應(yīng)中的作用［6，14-15］。通過ELISA 檢測發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者和膿毒癥小鼠的CCL15 含量同樣顯著升高，提示CCL15 參與膿毒癥免疫病理，且對膿毒癥診斷具有潛在價值。鑒于CCL15 表達水平在膿毒癥患者和膿毒癥小鼠中均顯著升高，為了進一步驗證CCL15 在膿毒癥中發(fā)揮的作用，通過給小鼠注射補充人CCL15 重組蛋白，評價其對生存率的影響。有研究表明C-X-C 亞族（α 亞族）趨化因子受體抑制可在一定時間范圍內(nèi)提高膿毒癥患者的生存率，體現(xiàn)了α 趨化因子在膿毒癥中的潛在免疫損害作用［16］。CCL15 作為β 亞族趨化因子的成員，本研究中通過注射CCL15 的重組蛋白，卻顯著提高了膿毒癥小鼠的生存率。進一步，在實驗性膿毒癥中發(fā)現(xiàn)，注射CCL15 蛋白可以改善小鼠器官損傷，促進細菌清除，從而發(fā)揮保護作用并提高膿毒癥小鼠的生存率。吞噬細胞是膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵細胞，在感染控制中發(fā)揮重要作用。有研究表明，IL-34在膿毒癥期間可以通過調(diào)控巨噬細胞的募集來改善生存率［17］。顆粒蛋白前體（progranulin）通過促進腹腔巨噬細胞的募集在膿毒癥中發(fā)揮保護作用［18］。這與本研究的結(jié)果一致，CCL15 可以促進膿毒癥小鼠PLF 中的巨噬細胞聚集，它在膿毒癥中的免疫保護作用可能是通過巨噬細胞來介導(dǎo)的。CCL15 在人骨肉瘤細胞中可以激活NF-κB，而NFκB 是調(diào)節(jié)激活巨噬細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［19-21］。也有研究表明，長鏈非編碼RNA NEAT1 調(diào)控NF-κB通路，在膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷中發(fā)揮重要作用［22］。通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，CCL15 蛋白處理可以在一定程度上促進巨噬細胞對細菌的吞噬殺傷，但沒有顯著差異。綜上所述，盡管對巨噬細胞的吞噬殺傷能力影響不大，CCL15 可通過顯著增加吞噬細胞數(shù)量來促進細菌清除。關(guān)于CCL15 在膿毒癥中如何參與疾病進程，其更加深入的分子機制需更進一步的研究。

綜上所述，CCL15 在膿毒癥中發(fā)揮免疫保護作用，通過促進巨噬細胞聚集，促進細菌清除，改善病理損傷，改善膿毒癥小鼠生存率。以上結(jié)果為進一步探究膿毒癥的發(fā)病機制和治療方法奠定了基礎(chǔ)。