正交試驗法優(yōu)選痔瘺凝膠的提取工藝

潘冬梅 酈 帥 洪順福 陳海紅 劉曉昱 何飛燕 陳紅梅

痔在臨床上是最常見的肛腸疾病，發(fā)病率占所有肛腸疾病的87.2%，主要表現(xiàn)為疼痛、便血、脫出、局部分泌物增多和排便困難等[1-2]。杭州市中醫(yī)院院內(nèi)制劑“痔瘺洗劑”[3]，由黃連、大黃、馬齒莧、蒼術(shù)、蒲公英、芒硝、明礬七味中藥材組成，在臨床上使用20余年，療效確切，主治濕熱、熱毒性痔瘡、肛裂。方中黃連、大黃清熱除濕、瀉下攻積，為君藥。馬齒莧清熱涼血消腫、蒼術(shù)燥濕祛風散寒，為臣藥。蒲公英利尿通淋、清熱散結(jié)，明礬燥濕止癢，芒硝清火消腫，為佐藥。但本品是玻璃瓶裝洗劑（規(guī)格為250mL/瓶），攜帶使用不便，現(xiàn)筆者將其劑型進行改進，制成外用凝膠。凝膠劑主要作用于皮膚、口腔、眼、鼻、陰道、直腸等，具有緩釋、控釋等功效[4]。本處方中藥材所含有效成分主要為有機酸、黃酮、生物堿、揮發(fā)油、萜類等，復方制劑的成分相對復雜，筆者選用乙醇為提取溶劑，對痔瘺洗劑處方藥材進行提取濃縮，制得流浸膏，并以小檗堿、大黃酸、大黃素的提取量和浸膏得率為考察指標，采用正交試驗法優(yōu)選最佳提取工藝條件，為該制劑的實際生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀 器 Agilent 高效液相色譜儀（1220 CL System VL），德國IKA 數(shù)顯型，RV10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海人和儀器有限公司），梅特勒XS-105 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），KQ-500E 型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），RE.52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），F(xiàn)W135粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2藥材、藥品及試劑 黃連（浙江錢王中藥有限公司，批號202105040）、大黃（浙江錢王中藥有限公司，批號202102009）、馬齒莧（杭州華東中藥飲片，批號20210617）、蒼術(shù)（浙江佐力百草中藥飲片有限公司，批號20210601）、蒲公英（浙江佐力百草中藥飲片有限公司，批號20210501）、芒硝（浙江錢王中藥有限公司，批號202101027）、明礬（杭州華東中藥飲片，批號20210505）；杭州市中醫(yī)院痔瘺洗劑（批號210527）；對照品：鹽酸小檗堿（批號Y31J9H67024）、大黃酸（批號T30A8F42628）、大黃素（批號T02S8F42983），均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇（天津市四友精細化學品有限公司）為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1中藥有效成分提取 將處方中各味中藥粉碎過篩，于烘箱中50℃烘干。按照處方比例稱取黃連、大黃、馬齒莧等中藥飲片各10g，置于提取罐中，按一定的料液比加入乙醇溶液，按正交試驗條件進行提取，提取液真空抽濾，棄去固體殘渣，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并定容于100mL 量瓶中，共制得9 份提取液，備用。

2.2正交試驗優(yōu)選提取工藝 采用L9（34）設(shè)計正交試驗，以小檗堿、大黃酸、大黃素的含量和出膏率為優(yōu)選條件的指標，選取的四個因素分別是：乙醇濃度（%）、乙醇倍量（倍）、提取時間（h）、提取次數(shù)（次），各3 個水平，重復3 次，采用正交試驗法選取最佳提取工藝，見表1。

表1 正交試驗因素與水平

2.3出膏率測定[5]精密吸取上述提取液各20mL，分別置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3h；移至干燥器中，冷卻30min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算出膏率：出膏率＝[干膏質(zhì)量（g）/藥材總質(zhì)量（g）]×100%。

2.4小檗堿、大黃酸、大黃素測定

2.4.1色譜條件[6-7]選用色譜柱為Agilent ZORBAX XDB-C18 柱（4.6×150mm，5μm）；流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液（90∶10），流速1.0mL/min；檢測波長：254nm；柱溫30℃；進樣量5μL。在該色譜條件下，樣品分離好。

2.4.2標準品對照溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品、大黃酸對照品、大黃素對照品適量，加甲醇分別制成每1mL 含鹽酸小檗堿91.20μg、大黃酸36.69μg、大黃素203.2μg 的對照品儲備液；再分別精密移取鹽酸小檗堿儲備液3mL、大黃酸儲備液12mL、大黃素儲備液4mL，置25mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液。見圖1。

圖1 對照品的圖譜

2.4.3供試品溶液制備[8]精密稱定樣品流浸膏1.0005g，置具塞平底燒瓶中，加入10%的NaCl 10mL。用力振搖，使沉析，過濾得濾液，加8%鹽酸溶液10mL，再加CHCl310mL，超聲20min，用CHCl3，萃?。? 次，10mL 次），合并CHCl3液，減壓回收溶劑至干，用甲醇定容至10mL，得供試樣品溶液，備用。見圖2。

圖2 空白對照的圖譜

2.4.4空白對照溶液制備 用缺黃連和大黃的中藥材按“2.1”項提取，按“2.4.3”項制備。見圖3。

圖3 供試品的圖譜

2.4.5線性關(guān)系考察 將混合對照品溶液，按“2.4.1”項的色譜條件和進樣標準依次進樣，記錄保留時間和峰面積。對照品的峰面積作為縱坐標，對照品在溶液中的濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，擬合回歸方程：鹽酸小檗堿：y=81863x-184130，R2=0.9959，大黃酸y=43483x-44858，R2=0.9989，大黃素y=58220x-441964，R2=0.9987，表明小檗堿、大黃酸、大黃素具有良好的線性關(guān)系。

2.4.6精密度試驗 取混合對照品某一適宜濃度的樣品溶液，按“2.4.1”項的色譜條件和進樣標準連續(xù)進樣6 次，記錄3 個標準品的保留時間和峰面積，計算三種成分的RSD 值。鹽酸小檗堿峰面積的RSD 為0.83%，大黃酸峰面積的RSD 為0.88%，大黃素峰面積的RSD 為0.34%，該結(jié)果說明，儀器的精密度適宜用作實驗分析。

2.4.7穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，按“2.4.1”項色譜條件，分別在0、1、2、3、4、5、6h 進樣，測定鹽酸小檗堿、大黃酸和大黃素的峰面積，流浸膏的峰面積RSD 分別為1.07%、1.12%、1.73%，表明供試品在6h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.8重復性試驗 取同一批供試品溶液6 份，進樣測定。結(jié)果顯示，6 份供試品的鹽酸小檗堿峰面積的RSD 為1.09%，大黃酸峰面積的RSD 為1.87%，大黃素峰面積的RSD 為2.03%

2.4.9正交試驗測定結(jié)果及方差分析 按照正交試驗設(shè)計表進行回流提取，得到9 份提取液，根據(jù)綜合評分法[9-10]，依據(jù)小檗堿、大黃酸、大黃素以及出膏率的重要性確定小檗堿的提取量權(quán)重0.4，大黃酸的提取量權(quán)重0.2，大黃素的提取量權(quán)重0.2，出膏率權(quán)重0.2，綜合評分=小檗堿含量/小檗堿最大含量×40%+大黃酸含量/大黃素最大含量×20%+大黃素含量/大黃素最大含量×20%+出膏率/出膏率最大值×20%，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 L9（34）正交試驗結(jié)果

表3 正交實驗結(jié)果數(shù)據(jù)方差分析表

根據(jù)表2-3 方差分析表明，各因素對提取影響大小的順序為提取次數(shù)＞乙醇濃度＞提取時間＞乙醇用量，其中提取次數(shù)對結(jié)果有顯著性影響，考慮到各類成本、能源消耗，時間成本，選定工藝為：A3B1C3D3，即用6 倍90%乙醇回流3 次，每次2h，濃縮，即制得流浸膏。

2.5提取工藝驗證試驗 為確保本試驗的準確性，按照處方比例稱取中藥飲片3 份，每份按以下條件提?。阂掖紳舛葹?0%，乙醇用量為6 倍，提取時間為2h，提取次數(shù)為3 次，測得小檗堿2678.97μg/mL（RSD=1.05%），大黃酸487.57μg/mL（RSD=1.89%），大黃素89.57μg/mL（RSD=2.31%），平均出膏率為17.52%（RSD=1.56%）。表明該工藝穩(wěn)定、可靠。

3 討論

痔瘺凝膠作為中藥制劑，其組成成分復雜，采用單一考察指標的提取工藝往往不夠全面，故本研究選用多個指標進行篩選，同時出膏率也是一個重要的指標，能整體反映提取的效率，具有現(xiàn)實意義。

初期HPLC 分析選用Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×150mm，5μm），流動相選用為甲醇（A）-磷酸鹽緩沖液（B）[11]，發(fā)現(xiàn)分離情況極不理想，無法實現(xiàn)分離目的。大黃酸更是因為在甲醇中溶解度較低，以及成分可能存在解離，標準品譜圖中時常出現(xiàn)較多雜峰。經(jīng)過反復的篩選，最后將選用色譜柱AgilentZORBAX XDB-C18 柱（4.6×150mm，5μm）流動相甲醇-磷酸鹽緩沖液換成為乙腈-磷酸鹽緩沖液（90∶10），小檗堿、大黃酸、大黃素的分離度達到檢測的要求。最終確定痔瘺凝膠的最佳提取條件為用6 倍于藥材量90%乙醇作提取溶劑，回流提取3 次，每次2h。本法簡便、選擇性好、提取效率高，經(jīng)濟，工藝穩(wěn)定可靠，為痔瘺凝膠的大批量工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。