二甲雙胍通過調節(jié)血管外周脂肪細胞的累積抑制腹主動脈瘤的形成*

田 麗，張瑾瑾，楊 柳，劉 肖，葉春芳，孟憲杰，李 會，張麗華，趙永波，馬 冬△

(1.河北省唐山市人民醫(yī)院內分泌科 063001；2.華北理工大學公共衛(wèi)生學院，河北唐山 063210;3.河北醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院心外科，石家莊 050000)

腹主動脈瘤(AAA)導致的主動脈破裂是老年人群中死亡的常見病因[1]，其主要病理學特征是血管系統(tǒng)炎癥和主動脈結構的病理性重塑，與年齡、性別、遺傳、吸煙、肥胖、血脂異常和高血壓等因素具有明顯的正相關關系[2]。目前臨床上尚無有效控制AAA進展或將其逆轉的藥物。血管外周脂肪組織具有較強應答高脂飲食帶來的脂肪異位沉積，促進血管外周脂肪細胞(PAs)堆積、炎癥產生和動脈粥樣硬化的發(fā)生[3]，提示PAs的累積在AAA發(fā)生中具有重要作用。DODERER等[4]研究發(fā)現，AAA外膜存在大量的脂肪細胞蓄積，并且證實了這些PAs促使AAA形成是一個新穎的病理生理機制。

二甲雙胍(Met)作為治療2型糖尿病的一線藥物，研究證實其不僅具有降糖作用，還包括減少系統(tǒng)炎癥和氧化應激，以及抑制細胞外基質重塑等功能[5]。有研究對合并糖尿病的AAA患者的用藥進行邏輯回歸分析發(fā)現，只有Met的使用與AAA的擴張呈負相關，提示Met可能對AAA的發(fā)生、發(fā)展有抑制作用，但其具體機制尚不明確[6-7]。另外，本課題組前期研究發(fā)現，缺氧誘導脂滴相關蛋白(HILPDA)分別在糖尿病和AAA患者血管組織中表達明顯升高，且有研究報道顯示，該蛋白作為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)的靶點參與脂肪積累、脂滴形成、巨噬細胞浸潤和動脈粥樣硬化進展[8-9]。因此，本課題組擬從Met對AAA形成影響的角度探討其具體分子機制，油紅染色觀察PAs的累積，采用免疫熒光染色、Western blot和實時定量PCR(qPCR)等實驗方法檢測脂滴形成、HILPDA和炎癥相關基因的表達，探討其作用機制，為有效抗炎治療AAA提供分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

Osmotic Pump緩釋泵購自明陽科華生物科技有限公司；血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)購于北京Solarbio公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、總蛋白提取試劑盒、高脂飼料(含0.15%膽固醇、21%脂肪)購自江蘇美迪森公司；4%多聚甲醛溶液購自北京雷根生物有限公司；10%山羊血清購自上海碧云天公司；anti-HILPDA抗體購自上海LSBio公司；FITC標記的熒光二抗購自美國Therno Fisher Scientitic公司；抗熒光淬滅封片液購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1AAA模型建立與分組干預

10只8～10周齡ApoE-/-雄性小鼠購自北京維通利華技術有限公司，飼養(yǎng)于華北理工大學實驗動物中心無特定病原體(SPF)級動物房，體重(27.0±1.2)g。小鼠皮下植入加AngⅡ的緩釋泵以1 000 ng·kg-1·min-1的釋放速度持續(xù)28 d并高脂飼養(yǎng)構建小鼠AAA模型，均分為兩組：AAA組和Met組,Met組通過飲水攝入Met(250 mg/kg)，每天1次。4周后水合氯醛麻醉取材，測量腹主動脈擴張尺寸，并采用油紅O染色觀察血管外周脂肪組織累積情況。一部分動脈置于4%多聚甲醛中固定不少于24 h，組織脫水透明，石蠟包埋，制作病理切片并進行烤片；另一部分置于液氮中，用于基因的表達分析。

1.2.2油紅O脂肪染色法

按照北京Solarbio公司油紅染色試劑盒說明書操作。將新取下的完整小鼠主動脈組織，采用0.5%的油紅O溶液孵育7～8 min，棄液體，PBS洗5遍，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3免疫熒光染色

石蠟包埋組織，4 μm切片，脫蠟至水，0.01 mol/L檸檬酸修復液高壓抗原修復，冷卻后PBS洗3遍，10%山羊血清孵育30 min；傾去血清，滴加適當比例稀釋的一抗?jié)窈兄? ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，熒光二抗室溫孵育，PBS避光沖洗，抗熒光淬滅劑避光封片，激光共聚焦顯微鏡觀察、照相。

1.2.4Western blot檢測

取出凍存的血管組織，置冰上充分研磨后加入組織裂解液，4 ℃離心提取蛋白；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干轉將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉中封閉，一抗4 ℃過夜，PBS洗膜，二抗孵育，再PBS洗膜，滴加ECL發(fā)光液，機器曝光顯影。

1.2.5qPCR

取出凍存的血管組織，Trizol提取總RNA，反轉錄cDNA，采用StepOnePlus Real-Time PCR System檢測基因腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6的轉錄水平，2-ΔΔCT方法計算目的基因的表達量，以GAPDH為內參。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 兩組小鼠瘤體直徑和PAs累積比較

通過對兩組小鼠主動脈樣本的外徑測量統(tǒng)計發(fā)現，與AAA組比較，Met組小鼠的瘤體直徑減小，差異有統(tǒng)計學意義[(1.98±0.05)mmvs.(2.37±0.09)mm,P<0.01]；同時，油紅O染色發(fā)現Met組小鼠的瘤體PAs累積較AAA組明顯減少，見圖1。

2.2 免疫熒光染色和Western blot檢測兩組PAs中脂滴形成和HILPDA的表達

免疫熒光染色結果發(fā)現，與AAA組比較，Met組PAs中脂滴形成減少，Met組HILPDA染色(紅色)較淺；Western blot進一步證實Met組HILPDA表達較AAA組減少，見圖2。

A:油紅染色(×5)，紅色部分代表小鼠主動脈外周脂肪組織油紅O染色結果，方框標注部分表示瘤體部位；B：瘤體直徑測量統(tǒng)計圖；a：P<0.01。

A:免疫熒光染色檢測(×630)，紅色染色代表HILPDA表達，藍色代表細胞核染色；B:Western blot；a：P<0.01,與AAA組比較。

2.3 qPCR檢測兩組小鼠瘤體組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達

qPCR檢測兩組小鼠瘤體外周脂肪組織中炎癥因子的表達結果顯示，與AAA組比較，Met組小鼠瘤體組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平降低(分別降低0.56倍、0.33倍和0.74倍)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05和P<0.01)，見圖3。

a:P<0.05;b:P<0.01。

3 討 論

AAA是血管外科最危險的疾病之一，血管細胞外基質改變、炎性反應、血管平滑肌細胞凋亡、氧化應激等參與其發(fā)病機制[10]。本研究采用AngⅡ灌注和高脂飲食誘導AAA小鼠模型證實了Met干預抑制AAA的作用，油紅O染色發(fā)現Met組小鼠瘤體外周PAs累積顯著減少；免疫熒光染色和Western blot檢測發(fā)現Met處理導致PAs脂滴形成減少和HILPDA表達水平降低，以及qPCR證實PAs中炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的表達水平同樣明顯降低，說明Met抑制AAA的作用與減少HILPDA表達及其介導的PAs脂滴形成，抑制血管外周脂肪組織增加帶來的炎癥環(huán)境相關。肥胖作為心血管疾病發(fā)病的主要因素之一，有研究發(fā)現，肥胖期間血管周圍脂肪組織表現出活動性局部炎癥，會增加主動脈瘤發(fā)病風險[11]，而Met可抑制多種代謝性疾病相關的炎性因子[12]，并且可以明顯抑制脂肪細胞的成脂分化[13]，說明本研究結果與以往報道一致，證實了以上結論。另外，臨床上AAA患者Met用藥隊列研究結果同樣發(fā)現，糖尿病患者采用Met治療可顯著降低AAA的膨脹速率[14]，提示本研究結論可能是其作用機制之一。

近年來有關Met抑制動脈瘤相關的機制研究主要是針對血管平滑肌細胞進行的，如WANG等[15]報道了Met抑制AngⅡ誘導的ApoE-/-小鼠AAA是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號途徑發(fā)揮抗AngⅡ誘導的血管平滑肌細胞增殖、凋亡、遷移和自噬的作用；LI等[16]研究發(fā)現Met具有調節(jié)血管平滑肌細胞表型轉換和炎癥因子分泌并抑制腦動脈瘤的作用，其分子機制是通過激活AMPK/ACC信號途徑實現的。本研究發(fā)現Met抑制AAA瘤體外周PAs的累積，進而抑制血管炎癥和AAA的形成是從另一個角度詮釋AAA的病理生理學機制，提示Met在多類型細胞中發(fā)揮抑制AAA形成和進展的作用。

值得注意的是，盡管在動物模型中已經證實了炎癥和蛋白降解機制的干預可以有效抑制AAA的形成和發(fā)展，但是目前臨床研究結果均以失敗告終，甚至某些炎癥干預措施會促使AAA的發(fā)展或者加速血管的破裂[17]。新近研究報道巨噬細胞中HILPDA表達的抑制能夠增強甘油三酯的脂解作用，減少脂滴形成[18]，但并沒有抑制脂肪組織中的炎癥水平，提示HILPDA作為分子治療靶點要考慮其組織細胞特異性，在巨噬細胞中抑制其表達對血管外周脂肪組織炎癥減少可能同樣沒有意義；與此相反，本研究結果表明在血管外周PAs中抑制HILPDA的表達卻能夠發(fā)揮重要的抗炎作用(減少脂肪組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達)，提示脂肪組織中HILPDA表達的抑制影響血管外周炎癥環(huán)境的分子機制研究將是重要方向。

綜上所述，Met通過抑制PAs中HILPDA的表達、減少脂滴的形成、脂肪細胞增殖及相關炎癥因子的表達來發(fā)揮抑制AAA的作用，HILPDA可能是一個新穎的分子治療靶點。