miR-191及miR-886-5p在肺結(jié)核外周血中的表達(dá)與臨床價值研究*

朱雄林，楊 梅，馮顯紅，李小林，章革民

(1.武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院感染科 430400；2.武漢市新洲區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科 430400；3.武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 430400；4.武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科 430400)

結(jié)核分枝桿菌感染后可導(dǎo)致肺結(jié)核，該疾病屬于慢性傳染病，使傳染病中導(dǎo)致死亡的首要原因，嚴(yán)重危害身體健康和生存質(zhì)量。每年因肺結(jié)核死亡的人數(shù)高達(dá)300萬[1]，而我國更是該疾病高發(fā)的國家，發(fā)病率居世界前5位。因此，尋找與肺結(jié)核相關(guān)的基因從而快速診斷肺結(jié)核，對有效控制肺結(jié)核的傳染具有重要臨床意義。

miRNAs 是真核生物內(nèi)源性非編碼RNA，可對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而影響細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和免疫應(yīng)答等多方面。例如miR-20a-5p、miR-181a-5p等被證明與肺結(jié)核的發(fā)病具有相關(guān)性，但目前關(guān)于miR-191、miR-886-5p是否與肺結(jié)核的發(fā)病有關(guān)的研究仍較少。因此，本研究探討肺結(jié)核患者miR-191、miR-886-5p的表達(dá)情況，以及其與肺結(jié)核診斷的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年8月在武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院就診的傳染病科確診為肺結(jié)核的患者50例作為結(jié)核組，潛伏感染結(jié)核桿菌的患者50例作為潛在感染組，選取同期在武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院體檢的健康者50例作為對照組。肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 288-2017)[2]。所有患者均知情同意。肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)至少1次痰細(xì)菌學(xué)檢查為陽性(包括痰涂片或痰培養(yǎng))；(2)胸部X線片檢查有典型的活動性結(jié)核病變；(3)肺組織病理學(xué)診斷為結(jié)核病變；(4)疑似肺結(jié)核病患者，隨訪觀察后抗結(jié)核藥物治療有效。符合上述項目之一者即可確診為肺結(jié)核。潛伏感染者：是機(jī)體對結(jié)核分支桿菌抗原刺激產(chǎn)生持續(xù)的免疫應(yīng)答但無明顯活動性結(jié)核病表現(xiàn)的患者。感染者沒有結(jié)核病的任何癥狀和體征，痰等各種標(biāo)本抗酸染色涂片和培養(yǎng)均為陰性，影像學(xué)檢查正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重肝臟、腎臟、心臟、血液疾病的患者；(2)腫瘤患者；(3)HIV、高血壓、糖尿病等慢性疾病的患者。

1.2 方法

血液樣本采集:3組受試者于入組后次日清晨采集2 mL空腹靜脈血置于肝素鈉處理的抗凝管中，混勻后-80 ℃保存。血漿 miRNA 提取:采用RNA試劑盒提取循環(huán) RNA，用Thermo 核酸檢測儀測定產(chǎn)物純度。將提取的各種miRNA 儲存于-80 ℃以防降解。miRNA 表達(dá)水平的檢測:采用miRNA檢測試劑盒按照說明書配置相應(yīng)反應(yīng)體系，將反應(yīng)底物∶逆轉(zhuǎn)錄引物∶酶(1∶1∶1)混勻后加入 miRNA 模板，離心后收集反應(yīng)產(chǎn)物。PCR逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，反應(yīng)條件設(shè)置為 40 ℃ 62 min，85 ℃ 8 min。將cDNA稀釋后采用qPCR法檢測Ct 值。將cDNA置于-20 ℃保存。以cDNA 為模板進(jìn)行PCR芯片檢測。將聚合酶、PCR引物、反應(yīng)底物、熒光染料置于反應(yīng)體系中，混勻后移取模板 cDNA，將96孔qPCR芯片在室溫條件下平衡好后，上樣。采用ABI3500 熒光定量 PCR儀進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件設(shè)置為 90 ℃ 10 min，90 ℃變性15 s，63 ℃ 退火15s，75 ℃延伸15 s，40個循環(huán)，并在延伸階段進(jìn)行熒光檢測，然后定量計算miR-191、miR-886-5p的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較

3組患者一般資料包括年齡、性別、吸煙、飲酒例數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組患者一般資料比較(n=50)

2.2 患者miR-191、miR-886-5p表達(dá)水平比較

與對照組相比，潛在感染組、結(jié)核組患者miR-191水平顯著降低，其中結(jié)核組患者miR-191水平最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，潛在感染組、結(jié)核組患者miR-886-5p水平顯著升高，其中結(jié)核組患者miR-886-5p水平最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 肺結(jié)核患者miR-191、miR-886-5p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)肺結(jié)核患者miR-191、miR-886-5p表達(dá)水平將患者分為低表達(dá)、高表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果表明，miR-191、miR-886-5p表達(dá)水平與肺部病灶個數(shù)、空洞個數(shù)均有顯著相關(guān)性(P<0.05)，與年齡、性別均無相關(guān)性(P>0.05)，見表3。

表2 3組患者miR-191、miR-886-5p表達(dá)水平比較

表3 肺結(jié)核患者miR-191、miR-886-5p表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.4 肺結(jié)核患者miR-191、miR-886-5p表達(dá)與年齡、性別、肺部病灶個數(shù)、空洞個數(shù)的Person相關(guān)性分析

經(jīng)Person相關(guān)性分析，miR-191、miR-886-5p表達(dá)與年齡(r=0.124、0.153,P>0.05)、性別(r=0.119、0.174,P>0.05)無明顯相關(guān)性；與肺部病灶個數(shù)(r=-0.265、0.248,P<0.05)、空洞個數(shù)(r=0.245、0.261,P<0.05)具有相關(guān)性。

2.5 miR-191、miR-886-5p診斷的ROC曲線分析

以結(jié)核組、潛伏感染組的miR-191、miR-886-5p的表達(dá)水平為檢驗變量，對照組為效應(yīng)變量。ROC曲線顯示miR-191的靈敏度為60.4%，特異度為74.0%，曲線下面積為0.699(P<0.05)。miR-886-5p的靈敏度為77.1%，特異度為66.7%，曲線下面積為0.751(P<0.05)。ROC曲線表明miR-191、miR-886-5p在診斷肺結(jié)核都有意義，miR-191、miR-886-5p聯(lián)合診斷時，靈敏度為80.2%，特異度為79.8%(P<0.05)，見圖1、表4。

2.6 肺結(jié)核相關(guān)因素的logistic回歸分析

將肺結(jié)核作為因變量，將年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、miR-191、miR-886-5p作為自變量，構(gòu)建logistic回歸分析模型，結(jié)果表明，miR-191、miR-886-5p是肺結(jié)核發(fā)生的影響因素，見表5。

表4 miR-191、miR-886-5p診斷的ROC曲線分析

圖1 miR-191、miR-886-5p診斷的ROC曲線

表5 肺結(jié)核相關(guān)因素的logistic回歸分析

3 討 論

機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，各個器官被結(jié)核分枝桿菌侵襲，但主要侵襲患者肺部發(fā)展為肺結(jié)核，患者可伴有全身乏力、咳嗽、咳血等癥狀，機(jī)體免疫力極度低下，嚴(yán)重者可致死亡[3]。由于肺結(jié)核的傳染性較強(qiáng)，且耐藥型結(jié)核菌大量出現(xiàn)，給肺結(jié)核的治療帶來極大困難，但若能早期診斷肺結(jié)核，及時控制肺結(jié)核的傳播，可大大降低肺結(jié)核的感染率。

研究表明，miRNA可直接或間接調(diào)控靶基因，參與細(xì)胞周期、增殖、凋亡等過程，在微生物感染、機(jī)體免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用[4]。例如，miR-150 通過調(diào)控PDCD4可對結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染THP-1巨噬細(xì)胞的炎癥、細(xì)胞增殖及凋亡發(fā)揮作用[5]；miR-191可通過調(diào)節(jié)炎癥因子反應(yīng)而參與砷暴露患者的腎功能障礙[6]。研究發(fā)現(xiàn)，活動性肺結(jié)核患者中miR-155的表達(dá)量增加了3.7倍[7]；miR-155是結(jié)核桿菌介導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡中所必需的成分[8]。人血清中miR-361-5p、miR-889、miR-576-3p的表達(dá)量在肺結(jié)核患者中顯著增高[9]。

本研究結(jié)果表明，與對照組相比，結(jié)核組患者miR-191表達(dá)水平最低(P<0.05)。結(jié)核組患者miR-886-5p水平顯著高于潛在感染組及對照組(P<0.05)。對臨床病理特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者miR-191、miR-886-5p表達(dá)水平與肺部病灶個數(shù)、空洞個數(shù)呈明顯相關(guān)性(P<0.05)，與年齡、性別無相關(guān)性(P>0.05)。當(dāng)機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌時，患者免疫力下降，結(jié)核菌大量繁殖后超出宿主細(xì)胞的免疫控制能力，導(dǎo)致肺部組織壞死，臨床表現(xiàn)為肺部空洞，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌快速生長時，感染越嚴(yán)重時，可加速對細(xì)胞外基質(zhì)的降解，利于肺部空洞的形成，而分子水平則表現(xiàn)為miR-191降低、miR-886-5p高于對照組。Logistic回歸分析表明miR-191、miR-886-5p是肺結(jié)核發(fā)生的影響因素。根據(jù)相關(guān)研究，miR-191位于染色體3p21.31，其異常表達(dá)與糖尿病、肺動脈高壓、炎性反應(yīng)等的發(fā)生具有相關(guān)性[10-11]。miR-191通過靶向抑制TIMP3激活基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等癌基因?qū)е路伟┘?xì)胞惡化[12]。因此，本研究推測miR-191、miR-886-5p可能通過抑制相關(guān)翻譯基因的表達(dá)，如MMP2、JNK等，而導(dǎo)致肺結(jié)核的發(fā)生與發(fā)展。研究表明，部分miRNA可通過調(diào)節(jié)熱休克蛋白的表達(dá)水平而使結(jié)核分枝桿菌滯留于巨噬細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而逃逸機(jī)體對其的免疫殺傷作用[13]。例如，miRNA-130b通過與miRNA-3-UTR結(jié)合而抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的基因轉(zhuǎn)錄，從而明顯降低其蛋白表達(dá)水平，同時還可抑制M2型巨噬細(xì)胞成熟，明顯降低炎性細(xì)胞因子的分泌[14]。因此，miR-191、miR-886-5p也可能通過調(diào)節(jié)熱休克蛋白的表達(dá)而使結(jié)核桿菌滯留于巨噬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)而引發(fā)肺結(jié)核的發(fā)生。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，大部分miRNA可介導(dǎo)慢性炎性反應(yīng)，包括結(jié)核病。如miR-223通過調(diào)控肺部髓樣細(xì)胞分泌的趨化因子CXC酶體2(CXCL2)、白細(xì)胞介素(IL)-6等水平而調(diào)控慢性炎癥，如結(jié)核病等[15-16]。注射卡介苗后，核因子(NF)-κB信號通路被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)miR-21的表達(dá)，miR-21作用于IL-12p35抑制IL-12的產(chǎn)生進(jìn)而損傷T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。miR-886-5p在肺結(jié)核患者表達(dá)上調(diào)，推測miR-886-5p可能與炎性反應(yīng)有關(guān)，通過靶作用于程序性細(xì)胞死亡而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[17]。本研究ROC曲線表明miR-191、miR-886-5p在診斷肺結(jié)核都有意義，miR-191、miR-886-5p聯(lián)合診斷時靈敏度和特異度均高于二者單獨診斷，二者聯(lián)合診斷的靈敏度為80.2%，特異度為79.8%(P<0.05)。

由此可見，肺結(jié)核患者miR-191、miR-886-5p分子的差異性表達(dá)，可較好反映機(jī)體感染結(jié)核桿菌后機(jī)體發(fā)生的免疫應(yīng)答，可作為判斷肺結(jié)核嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。