新型冠狀病毒侵染所需宿主基因TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2重要功能變異分析

陳慧珍，楊健康

【摘要】 目的 研究新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）侵染所需宿主基因TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2的重要功能變異在全世界不同人群間的分布差異。

方法 使用GTEx數(shù)據(jù)庫，在新型冠狀病毒的主要侵染器官肺中分析TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因的eQTL位點(diǎn)。使用1 k GP（千人基因組計(jì)劃）數(shù)據(jù)庫，系統(tǒng)分析上述4個(gè)基因的錯(cuò)義變異在世界不同人群間的分布差異，并使用PolyPhen-2和SIFT軟件預(yù)測錯(cuò)義突變導(dǎo)致的氨基酸替代是否影響蛋白功能。

結(jié)果 在肺中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)q值小于0.05的eQTL位點(diǎn)，分別為TMPRSS2基因的rs35074065、CTSL基因的rs2378757、PIKFYVE基因的rs12475932、TPCN2基因的rs930786。TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因的4個(gè)eQTL位點(diǎn)可能與上述4個(gè)基因在東亞人群中的較低表達(dá)水平有關(guān)。在TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因上分別有10、6、15、30個(gè)有害錯(cuò)義變異，大部分變異都是低頻變異，其中大多數(shù)僅在一個(gè)人群中具有特異性。唯一的例外是TPCN2基因的變異位點(diǎn)rs78034812，它在全球的等位基因頻率大于1%，在東亞人群中具有最高的等位基因頻率且該位點(diǎn)在物種間具有保守性。

結(jié)論 TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因存在重要功能變異，這些變異的等位基因頻率在不同人群間存在差異，可能影響基因的表達(dá)和功能，從而影響人群對(duì)新型冠狀病毒的易感性以及感染后癥狀的差異。

【關(guān)鍵詞】 新型冠狀病毒;TMPRSS2;CTSL;PIKFYVE;TPCN2;人群;變異

中圖分類號(hào)：R181.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.02.002

Analysis of important functional variation of host genes required for SARS-CoV-2： TMPRSS2， CTSL， PIKFYVE and TPCN2

[HJ1][HJ]

CHEN Huizhen， YANG Jiankang

（Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology of School of Basic Medical Sciences， Dali University， Dali 671000， Yunnan， China）

【Abstract】 Objective To study the distribution differences of important functional variants of the host genes TMPRSS2， CTSL， PIKFYVE and TPCN2 required for SARS-CoV-2 infection among different populations in the world.

Methods GTEx database was used， and the eQTL loci of the TMPRSS2， CTSL， PIKFYVE， and TPCN2 genes in the lungs of the main infecting organs of the SARS-CoV-2 were analyzed. 1k GP （1000 Genomes Project） database was used， and the distribution of missense variants of the above-mentioned 4 genes among different populations in the world were systematically analyzed， and PolyPhen-2 and SIFT software were used to predict whether amino acid substitutions caused by missense mutations to affect protein function.

Results 4 eQTL loci with q value less than 0.05 were found in the lungs， including rs35074065 of TMPRSS2 gene， rs2378757 of CTSL gene， rs12475932 of PIKFYVE gene， and rs930786 of TPCN2 gene. The 4 eQTL loci of TMPRSS2， CTSL， PIKFYVE， and TPCN2 genes may be related to the lower expression levels of the above-mentioned 4 genes in East Asian populations. There were 10， 6， 15， and 30 deleterious missense variants in TMPRSS2， CTSL， PIKFYVE， and TPCN2 genes， respectively. Most of the variants were low-frequency variants， and most of them were specific in only one population. The only exception was rs78034812， a variant in the TPCN2 gene， which had an allele frequency greater than 1% worldwide. It had the highest allele frequency in East Asian populations and this locus was conserved among species.

Conclusion There are important functional variations in TMPRSS2， CTSL， PIKFYVE， and TPCN2 genes. The allele frequency of these variants vary among different populations， which may affect gene expression and function， thereby affecting the population's susceptibility to the SARS-CoV-2 and the difference in symptoms after infection.

【Key words】 SARS-CoV-2; TMPRSS2; CTSL; PIKFYVE; TPCN2; population; mutation

新型冠狀病毒肺炎是指由一種β新型冠狀病毒，新型致病性SARS冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的傳染性呼吸道疾病[1]，以發(fā)熱、咳嗽、頭痛、乏力、呼吸困難等癥狀為主要臨床表現(xiàn)的病毒性肺炎[2]。全球SARS-CoV-2的流行構(gòu)成全球衛(wèi)生緊急情況[3]。SARS-CoV-2侵染細(xì)胞依賴于病毒刺突（S）蛋白與細(xì)胞受體ACE2的結(jié)合[4]，以及跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS2基因）和組織蛋白酶L（CTSL基因）等蛋白酶對(duì)病毒S蛋白的活化[5]。SARS-CoV-2侵染293/hACE2細(xì)胞的過程主要是通過內(nèi)吞作用介導(dǎo)的，而阻斷PIKfyve（PIKFYVE基因）和TPCN2（TPCN2基因）能強(qiáng)烈抑制SARS-CoV-2進(jìn)入細(xì)胞，這說明PIKfyve和TPC2對(duì)病毒進(jìn)入細(xì)胞至關(guān)重要[6]。

TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因?qū)τ赟ARS-CoV-2侵染宿主細(xì)胞都發(fā)揮了重要的作用，因此研究上述基因的重要功能變異在全世界不同人群間的分布差異也具有重要的意義。許多基因變異位點(diǎn)，包括編碼區(qū)錯(cuò)義突變和表達(dá)定量性狀位點(diǎn)（eQTL），都可能影響這些基因的表達(dá)和功能。進(jìn)一步在世界不同人群中對(duì)這4個(gè)基因進(jìn)行遺傳分析，有助于解釋疾病的癥狀及易感性差異?，F(xiàn)將對(duì)4個(gè)基因的遺傳變異，包括eQTL位點(diǎn)和功能編碼區(qū)錯(cuò)義變異在人群中的分布差異進(jìn)行分析，旨在為新型冠狀病毒在世界不同人群中傳播的流行病學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因eQTL的人群分布

新型冠狀病毒主要靶器官是肺，因此分析肺組織的eQTL位點(diǎn)[7]。使用GTEx數(shù)據(jù)庫[8]，選擇q值小于0.05的位點(diǎn)作為與肺組織表達(dá)相關(guān)的eQTL位點(diǎn)。1 k GP（千人基因組計(jì)劃）的數(shù)據(jù)庫[9]包括2504個(gè)個(gè)體的全基因組突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)。從1 k GP的數(shù)據(jù)庫中下載TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因的eQTL位點(diǎn)的等位基因頻率數(shù)據(jù)。分別統(tǒng)計(jì)南亞、歐洲、東亞、美洲和非洲5類人群的等位基因頻率分布。

1.2 TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因錯(cuò)義突變的人群分布

從1 k GP數(shù)據(jù)庫中下載TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因編碼區(qū)的錯(cuò)義突變數(shù)據(jù)，并使用PolyPhen-2和SIFT軟件預(yù)測錯(cuò)義突變導(dǎo)致的氨基酸替代是否影響蛋白功能。SIFT軟件中，預(yù)測結(jié)果小于0.05則為有害變異。PolyPhen-2軟件中，預(yù)測結(jié)果大于0.4470則為有害變異。分別計(jì)算錯(cuò)義突變和有害錯(cuò)義突變的等位基因頻率的世界主要人群分布，并用Ensembl數(shù)據(jù)庫[10]檢查部分重要突變的物種保守性。

2 結(jié) 果

2.1 TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因eQTL位點(diǎn)的人群分布

本研究使用GTEx數(shù)據(jù)庫，在肺組織中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)q值小于0.05的eQTL位點(diǎn)，分別為TMPRSS2的rs35074065、CTSL的rs2378757、PIKFYVE的rs12475932、TPCN2的rs930786。使用1 k GP數(shù)據(jù)比較了不同人群中4個(gè)eQTL位點(diǎn)的等位基因頻率分布差異，結(jié)果表明，位于TMPRSS2基因上的eQTL變異rs35074065（等位基因?qū)Ρ磉_(dá)的影響值為0.2749）在東亞人群中的等位基因頻率最低（0.0060）。與其他人群相比，在東亞人群中TMPRSS2基因上的rs35074065和TPCN2基因上的rs930786兩個(gè)eQTL變異的等位基因頻率明顯低于其他人群。而其他兩個(gè)eQTL變異（CTSL的rs2378757和PIKFYVE的rs12475932）具有更高的等位基因頻率。例如，位于CTSL基因中的eQTL變異rs2378757（等位基因?qū)Ρ磉_(dá)的影響值為-0.2319）的等位基因頻率在東亞人群中最高（0.9831）。見表1。

2.2 TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因錯(cuò)義突變的人群分布

本研究統(tǒng)計(jì)了來自1 k GP數(shù)據(jù)庫的TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因編碼區(qū)所有錯(cuò)義突變的數(shù)量和頻率分布（表2），重點(diǎn)對(duì)這4個(gè)基因的有害錯(cuò)義突變的人群分布進(jìn)行了分析。

表3結(jié)果顯示TMPRSS2基因中10個(gè)有害錯(cuò)義突變的等位基因頻率。所有這些變異在5個(gè)人群中都是低頻變異，且其中大多數(shù)僅在一個(gè)人群中具有特異性。例如，rs544474510、rs372286621、rs190265904這三個(gè)變異位點(diǎn)對(duì)于東亞人群是特異的，其他人群中不存在相關(guān)突變。表4～表6的結(jié)果分別顯示，CTSL、PIKFYVE、TPCN2中有6個(gè)、15個(gè)、30個(gè)有害錯(cuò)義突變。除TPCN2基因上的rs78034812等位基因頻率>0.01外，這些大多數(shù)變異在所有人群中都是低頻變異。

我們?cè)噲D評(píng)估這4個(gè)基因的所有有害錯(cuò)義突變的總攜帶率。這4個(gè)基因的總攜帶率也很低（表2），但在人群之間差異很大。TPCN2具有比其他三個(gè)基因更多的有害錯(cuò)義突變。東亞人群中的總攜帶率是全球人口的兩倍。

3 討 論

新型冠狀病毒具有很強(qiáng)的傳播性和致病性，容易引起呼吸道感染，導(dǎo)致病毒性肺炎[11]。截至北京時(shí)間2021年4月13日，全球累計(jì)確診病例達(dá)1億3千萬人，累計(jì)死亡病例達(dá)290萬余人。這些數(shù)字仍以驚人的速度增長，這使全世界的公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)受到巨大影響[12]。目前為止，尚無針對(duì)新型冠狀病毒肺炎的特效治療手段。我們通過研究TMPRSS、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因上的功能變異位點(diǎn)，鑒定這些基因中自然發(fā)生的重要功能變異，這些變異可能影響不同群體間基因功能或表達(dá)的差異。

SARS-CoV-2的生命周期可分為三個(gè)階段：進(jìn)入宿主細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸，病毒基因組的復(fù)制，以及新病毒粒子的包裝成熟和排出[13]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的蛋白（NSP1、NSP5、ORF8等）可與人類宿主蛋白相互作用。并發(fā)現(xiàn)不同新型冠狀病毒蛋白可參與多種復(fù)合物的形成和生物學(xué)過程，包括DNA復(fù)制、表觀遺傳學(xué)和基因表達(dá)的調(diào)控、囊泡運(yùn)輸、脂類修飾等。如NSP5可能抑制人類HDAC2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，并可能影響HDAC2介導(dǎo)的炎癥和干擾素反應(yīng)。ORF8可參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白質(zhì)加工過程[14]。另有研究表明，宿主細(xì)胞RNA結(jié)合蛋白（TIA1、SND1、IGF2BP1、DDX42等）可與SARS-CoV-2 RNA基因組相互作用。此外，下調(diào)4個(gè)基因TIA1、SND1、IGF2BP1、DDX42的表達(dá)顯著降低了受感染細(xì)胞中SARS-CoV-2基因組RNA的總量[15]。

目前已有研究表明，新型冠狀病毒除了對(duì)肺有影響外，還會(huì)對(duì)胃腸道產(chǎn)生影響，常表現(xiàn)為腹瀉、惡心和嘔吐[16]。同時(shí)，SARS-CoV-2也可以侵染神經(jīng)細(xì)胞，使機(jī)體出現(xiàn)頭痛、頭暈等癥狀[17]。極少數(shù)患者甚至還會(huì)出現(xiàn)幻覺、躁動(dòng)等精神方面的表現(xiàn)[18]。不僅如此，SARS-CoV-2還會(huì)導(dǎo)致急性腎損傷、急性心肌損傷等嚴(yán)重的并發(fā)癥[19～20]。

本研究系統(tǒng)地分析了TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因中重要的功能變異，包括eQTL變異。結(jié)果顯示與其他人群相比，在東亞人群中TMPRSS2基因中的rs35074065和TPCN2基因中的rs930786這兩個(gè)eQTL變異的等位基因頻率明顯低于其他人群。相反，其他兩個(gè)eQTL變異（CTSL基因中的rs2378757和PIKFYVE基因中的rs12475932）在東亞人群中比其他人群具有更高的等位基因頻率。這些發(fā)現(xiàn)表明，TMPRSS2、CTSL、PIKFYVE、TPCN2基因的eQTL位點(diǎn)可能與它們?cè)跂|亞人群中的較低表達(dá)水平相關(guān)。

除TPCN2基因中的rs78034812外，其他大多數(shù)變異在所有人群中都是低頻變異。rs78034812在東亞人群具有最高的等位基因頻率，頻率高達(dá)3.87%，奇怪的是非洲人群中不存在該變異。而此變異會(huì)導(dǎo)致TPCN2蛋白第681位氨基酸殘基從絲氨酸變?yōu)榱涟彼?，從親水性氨基酸變?yōu)槭杷园被?。使用Ensembl數(shù)據(jù)庫檢查這個(gè)變異的保守性，發(fā)現(xiàn)這個(gè)變異在靈長類動(dòng)物和哺乳動(dòng)物中都是保守的。因此，此變異與TPCN2蛋白功能的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。雙孔通道（TPCs）是位于宿主細(xì)胞內(nèi)溶酶體區(qū)室膜上的鈣陽離子通道，SARS-CoV-2依賴于這些細(xì)胞器進(jìn)行感染和復(fù)制。TPCs的兩種亞型TPC1和TPC2主要分布在溶酶體內(nèi)，而TPC2主要位于晚期溶酶體區(qū)室[21]。TPCs直接參與鈉外流，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓，使得囊泡表面積與體積比發(fā)生顯著變化。因此，TPCs抑制劑可抑制溶酶體的融合潛力進(jìn)而限制病毒侵染[22]。有研究表明，抑制劑粉防己堿、柚皮素阻斷TPC2活性時(shí)，SARS-CoV-2侵染細(xì)胞的能力會(huì)被抑制[6，23]。

另外，我們發(fā)現(xiàn)雖然這4個(gè)基因的有害錯(cuò)義突變總攜帶率很低，但在人群之間差異很大。TPCN2具有比其他三個(gè)基因更多的有害錯(cuò)義突變。東亞人群中的總攜帶率是全球人口的兩倍。不同人群之間功能變異的等位基因頻率差異表明，遺傳基礎(chǔ)的多樣性可能影響人群之間相應(yīng)基因的功能。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-09-28 修回日期：2021-12-06）

（編輯：梁明佩）