H5 亞型2.3.4.4 分支禽流感病毒HA 基因重組質(zhì)粒的免疫保護(hù)效力研究

李炯頡，梁真潔，陳普成，曾顯營，柳金雄，鄧國華，姜永萍，陳化蘭

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）是由正粘病毒科流感病毒屬A 型流感病毒引發(fā)的一種傳播快、死亡率高的禽類烈性傳染病。HPAI 不僅對(duì)家禽造成嚴(yán)重危害，也對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，近年來該類病毒感染人的事件時(shí)有發(fā)生。血凝素（HA）是流感病毒囊膜纖突的重要組成部分，是參與禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）與細(xì)胞表面受體結(jié)合的主要蛋白[1]。因此，HA 蛋白是保護(hù)性免疫應(yīng)答的主要靶抗原，針對(duì)HA 蛋白的抗體能夠阻止病毒吸附和病毒侵入宿主細(xì)胞，從而保護(hù)機(jī)體免受病毒的感染[2]。

接種疫苗一直是控制AIV 傳播最有效的手段，基于基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，各種新型疫苗相繼研發(fā)并投入使用。DNA 疫苗是將編碼相關(guān)抗原蛋白的基因插入到質(zhì)粒載體中，將重組質(zhì)粒直接注射動(dòng)物，通過在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相關(guān)抗原基因誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。DNA 疫苗能真實(shí)地呈現(xiàn)外源基因編碼蛋白的抗原性，并能同時(shí)激發(fā)細(xì)胞與體液免疫應(yīng)答反應(yīng)；遞呈的免疫源單一，免疫持續(xù)期長、可以反復(fù)加強(qiáng)免疫；免疫接種與自然感染動(dòng)物可以利用特異性診斷試劑進(jìn)行鑒別，具有長遠(yuǎn)的開發(fā)前景[3]。2018年，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的H5 亞型禽流感DNA 疫苗獲得了國家一類新獸藥證書，是中國首個(gè)獲得批準(zhǔn)的禽流感DNA 疫苗。

AIV HA 抗原基因不斷進(jìn)化導(dǎo)致的抗原變異是影響原有疫苗無法提供完全免疫保護(hù)的主要原因，因此需要實(shí)時(shí)構(gòu)建并更新疫苗株[4]。流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果表明，H5 亞型2.3.4.4d 分支是目前影響我國部分地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)的主要AIV，根據(jù)抗原性和遺傳演化分析結(jié)果，本研究選擇A/Duck/Guizhou/S4184/2017（H5N6）（簡稱DK/GZ/S4184/2017（H5N6））株作為2.3.4.4d 分支代表AIV，以其HA 基因構(gòu)建重組質(zhì)粒并進(jìn)行免疫效力評(píng)估，為防控該分支AI 提供有效的疫苗儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料pCAGGs 質(zhì)粒、攻毒用H5 亞型高致病性AIV（HPAIV）DK/GZ/S4184/2017（H5N6）、HPAIV DK/GD/S1110/2019（H5N6）、HPAIV DK/GX/1/2018（H5N6）、HPAIV DK/HuN/SE0110/2018（H5N6）株及其標(biāo)準(zhǔn)抗原和對(duì)應(yīng)的H5N6 AIV 多克隆抗體、293T 細(xì)胞均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室保存；E. coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Q5 高保真酶和內(nèi)切酶EcoR I/XhoI 等均購自NEB 公司；Lipofectamin 3000 轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen 公司；兔抗雞IgGFITC 購自Sigma 公司；兔抗GAPDH 單克隆抗體（MAb）購自Santa Cruz Biotechnology 公司；鼠抗兔IgG-DyLight800、驢抗雞Ig（H+L）-Dylight800 抗體購自O(shè)dyssey 公司。引物均由庫美公司合成。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與PCR 鑒定將DK/GZ/S4184/2017（H5N6）株HA 基因的密碼子優(yōu)化為雞體所偏嗜的密碼子，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。優(yōu)化的HA 基因經(jīng)EcoR I/XhoI 雙酶切后定向克隆至pCAGGs 載體，構(gòu)建的重組質(zhì)粒采用載體引物進(jìn)行PCR 和測序鑒定后，命名為pCA-S4184。

1.3 目的蛋白表達(dá)的間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）及western blot 鑒定待293T 細(xì)胞狀態(tài)良好、密度約為8×105個(gè)/mL 時(shí)，利用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑分別將重組質(zhì)粒pCA-S4184 及對(duì)照質(zhì)粒pCAGGs 轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h 后采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，以H5N6 AIV 多克隆抗體（1∶300）為一抗，兔抗雞IgG-FITC（1∶1 000）為二抗經(jīng)IFA 檢測。另外收集細(xì)胞后經(jīng)RIPA 裂解，以H5N6 AIV 多克隆抗體（1∶300）為一抗，以驢抗雞Ig（H+L）-Dylight800（1∶5 000）為二抗經(jīng)western blot 鑒定，分析HA 蛋白的表達(dá)情況，并以GAPDH 作為293T 細(xì)胞基因正常表達(dá)的對(duì)照。以上試驗(yàn)均設(shè)未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞作為空白對(duì)照。

1.4 SPF 雞的免疫試驗(yàn)設(shè)計(jì)將重組質(zhì)粒pCAS4184 以肌肉注射的方式免疫3 周齡SPF 雞，免疫以及分組情況見表1，并在首次免疫及攻毒后每周采血，采用紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）檢測HI 抗體水平（HI 抗體滴度為1∶4 以上為陽性）。

表1 SPF雞的免疫試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of SPF chickens

1.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn)加強(qiáng)免疫后一周（首免后28 d），分別經(jīng)滴鼻途徑感染105EID50/0.1 mL/只的1 株同源HPAIV DK/GZ/S4184/2017（H5N6）株、3 株同分支異源HPAIV DK/GD/S1110/2019（H5N6）、DK/GX/1/2018（H5N6）、DK/HuN/SE0110/2018（H5N6）株，攻毒后在14 d 的觀察期內(nèi)每天記錄免疫組和對(duì)照組雞的發(fā)病和死亡情況。

1.6 攻毒后實(shí)驗(yàn)雞的排毒檢測分別于攻毒后的3 d、5 d 和7 d 無菌采集各組雞的喉頭和泄殖腔棉拭子，置于含氨芐青霉素和鏈霉素的無菌PBS中，取100 μL 10 倍倍比稀釋后接種9 日齡～11 日齡雞胚，37 ℃孵化48 后經(jīng)血凝試驗(yàn)檢測雞胚尿囊液的HA 效價(jià)，加入50 μL 1%紅細(xì)胞懸液，并根據(jù)Reed-Meunch 法計(jì)算所分離病毒的滴度。

1.7 抗體持續(xù)期試驗(yàn)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCAS4184 以15 μg/只兩次免疫3 周齡SPF 雞，免疫組30只，對(duì)照組15 只。免疫后每隔2 周采集其翅靜脈血檢測HI 抗體，分析HI 抗體的動(dòng)態(tài)消長規(guī)律，評(píng)估該重組質(zhì)粒的免疫保護(hù)期；分別在首免后第12 周和24 周，隨機(jī)選取8 只免疫雞，連同日齡相同的8 只對(duì)照組雞分別用105EID50/0.1 mL/只劑量攻擊同源HPAIV DK/GZ/S4184/2017（H5N6）株，攻毒后14 d 觀察期內(nèi)每天記錄各組雞的發(fā)病和死亡情況；分別在攻毒后的3 d、5 d 和7 d 采集每只雞的泄殖腔拭子和喉頭拭子進(jìn)行病毒的分離與滴定，檢測攻毒后各組雞的排毒情況。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pCA-S4184 的構(gòu)建與鑒定結(jié)果將DK/GZ/S4184/2017（H5N6）株HA 基因的密碼子優(yōu)化后經(jīng)公司合成，并克隆至pCAGGS 載體中。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR 鑒定，結(jié)果顯示擴(kuò)增的目的條帶均正確（圖1），并且測序結(jié)果與預(yù)期完全符合。表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCA-S4184。

圖1 重組質(zhì)粒pCA-S4184的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of pCA-S4184 by PCR

2.2 目的蛋白表達(dá)的IFA 及western blot 鑒定結(jié)果分別將重組質(zhì)粒pCA-S4184 和空載體pCAGGs 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞48 h 后，分別經(jīng)IFA 和western blot 鑒定。IFA 結(jié)果顯示，pCA-S4184 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中可觀察到綠色熒光，而空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白細(xì)胞中則無綠色熒光（圖2A）；Western blot 結(jié)果顯示，pCA-S4184 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中出現(xiàn)約74 ku 的特異性條帶，空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與空白對(duì)照細(xì)胞中均無該特異性條帶。但不同載體轉(zhuǎn)染的293T 細(xì)胞及空白細(xì)胞中均檢測到了GAPDH 的表達(dá)（圖2B），以上結(jié)果表明DK/GZ/S4184/2017（H5N6）株HA 基因在293T 細(xì)胞中獲得了表達(dá)，且具有良好的反應(yīng)原性。

圖2 HA基因在293T細(xì)胞中表達(dá)的IFA(A)及western blot（B）鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of HA gene expression by IFA(A)and western blot(B)

2.3 重組質(zhì)粒免疫后的HI 抗體檢測結(jié)果將pCAS4184 以15 μg/只免疫SPF 雞，3 周后加強(qiáng)免疫，一周后，分別經(jīng)滴鼻感染同源或同分支異源病毒。免疫及攻毒后每周采血檢測HI 抗體水平。結(jié)果顯示，加強(qiáng)免疫之前各組免疫雞針對(duì)DK/GZ/S4184/2017（H5N6）抗原的HI 抗體均維持在較低水平；加強(qiáng)免疫后一周，4 組免疫雞針對(duì)該抗原的HI 抗體平均水平分別為1∶11、1∶11、1∶8、1∶11，PBS 對(duì)照組雞的HI 抗體均為0。所有免疫雞的HI 抗體水平在攻毒后1 周均有明顯升高，平均HI 抗體在1∶16 左右（圖3）。表明，重組質(zhì)粒pCA-S4184 具有良好的免疫原性，可以誘導(dǎo)SPF 雞產(chǎn)生相應(yīng)的HI 抗體。

圖3 免疫雞HI抗體檢測結(jié)果Fig.3 Results of the HI antibodies in vaccinated chickens

2.4 攻毒后各組雞發(fā)病、死亡及排毒檢測結(jié)果首免后28 d，分別用致死劑量的1 株同源和3 株同分支異源HPAIV 攻擊后，在14 d 的觀察期內(nèi)每天記錄各組雞的發(fā)病和死亡情況并在攻毒后的不同時(shí)間采集各組雞的喉頭和泄殖腔棉拭子進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，4組對(duì)照雞在攻毒后2 d～5 d全部發(fā)病死亡，并大量排毒；攻擊DK/GZ/S4184/2017（H5N6）、DK/GX/1/2018（H5N6）和DK/HuN/SE0110/2018（H5N6）株病毒的所有免疫雞均健活，無發(fā)病也無排毒，攻擊DK/GD/S1110/2019（H5N6）株病毒的免疫組中雖有個(gè)別雞有低劑量的一過性排毒，但均獲得了100%的免疫保護(hù)率（表2）。上述結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pCA-S4184 的免疫效果良好，15 μg/只的劑量即可對(duì)SPF 雞提供100%的抵抗同源和同分支異源病毒攻擊的能力，而且能顯著降低攻毒后的排毒量。

表2 各組雞攻擊H5N6 AIV 后的排毒檢測結(jié)果Table 2 Virus shedding from SPF chickens infected with H5N6 AIV

2.5 重組質(zhì)粒免疫SPF 雞后的HI 抗體持續(xù)期檢測結(jié)果重組質(zhì)粒pCA-S4184 以15 μg/只免疫SPF 雞，3周后加強(qiáng)免疫，免疫后每周采血，檢測HI 抗體并分析其動(dòng)態(tài)消長規(guī)律。結(jié)果顯示，首免后3 周，免疫雞的平均HI抗體為1∶4，加強(qiáng)免疫后2周，平均HI抗體可上升至1∶37，其后平均HI 抗體保持在1∶11～1∶64，免疫后25 周，免疫雞平均HI 抗體水平還可達(dá)1∶11，對(duì)照組雞的HI 抗體始終為0（圖4）。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pCA-S4184 所誘導(dǎo)的HI 抗體可持續(xù)25 周以上。

圖4 HI抗體持續(xù)期檢測結(jié)果Fig.4 Results of the HI antibody duration

2.6 重組質(zhì)粒免疫SPF 雞后的持續(xù)期攻毒試驗(yàn)結(jié)果首免后的第12 周和24 周，分別隨機(jī)選取8 只免疫雞及8 只對(duì)照組雞分別用致死劑量的同源病毒攻擊，在14 d 觀察期內(nèi)每天記錄試驗(yàn)雞的發(fā)病和死亡情況；分別在攻毒后的不同時(shí)間采集每只雞的泄殖腔和喉頭拭子進(jìn)行病毒的分離與滴定。結(jié)果顯示，免疫雞在攻毒后均存活，可完全抵御HPAIV DK/GZ/S4184/2017（H5N6）的攻擊，且無排毒現(xiàn)象（表3）。上述結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pCA-S4184 的免疫持續(xù)保護(hù)期較長，在首免后第24 周仍可以抵御同源病毒的致死性攻擊。

表3 免疫持續(xù)期內(nèi)SPF雞攻擊H5N6 AIV 后的排毒檢測結(jié)果Table 3 Virus shedding from SPF chickens infected with H5N6 AIV in HI antibody duration

3 討 論

近年來，H5N6 亞型AIV 逐漸取代H5N1 亞型AIV，成為我國家禽和活禽市場中流行的主要AIV[5-7]。H5 亞型AIV 的高突變率和死亡率，對(duì)禽類養(yǎng)殖業(yè)以及公共衛(wèi)生安全，乃至社會(huì)的穩(wěn)定都造成了很大的影響。疫苗免疫是防制AI 的主動(dòng)措施和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而疫苗的免疫效率取決于流行株與疫苗株之間的抗原性匹配程度，鑒于流感病毒的高突變率，只有抗原性匹配的疫苗才能為動(dòng)物機(jī)體提供堅(jiān)實(shí)有效的免疫力[8]。2017 年底以來的流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果顯示，H5亞型2.3.4.4分支AIV已在19個(gè)省份分離到，并可進(jìn)一步分為2.3.4.4b 分支、2.3.4.4c 分支、2.3.4.4d分支，其中以2.3.4.4d分支為主[9]。因此有必要研制和更新針對(duì)2.3.4.4分支AIV的禽流感DNA疫苗。

經(jīng)過多年研究，本實(shí)驗(yàn)室建立了系統(tǒng)的禽流感DNA 疫苗研制平臺(tái)，構(gòu)建了一系列不同抗原分支的AIV DNA 疫苗，但不同抗原分支AIV HA 基因的免疫原性有差異，動(dòng)物試驗(yàn)表明，10 μg 及以上相應(yīng)質(zhì)粒的免疫劑量可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的HI 抗體水平，并可抵御同源病毒的致死性攻擊[10-12]。本研究根據(jù)雞的偏嗜性對(duì)HPAIV S4184（H5N6）株的HA 基因優(yōu)化并合成后插入到pCAGGs 載體中，構(gòu)建了表達(dá)2.3.4.4 分支AIV代表株DK/GZ/S4184/2017（H5N6）HA 基因的重組質(zhì)粒pCA-S4184，IFA 和western blot 鑒定結(jié)果顯示，該HA 基因可以在293T 細(xì)胞中表達(dá)，為了評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)效果，進(jìn)行了一系列免疫效力評(píng)估試驗(yàn)：以15 μg 劑量免疫3 周齡SPF 雞，首免后3 周以同樣劑量和方式加強(qiáng)免疫，1 周后分別用105EID50/0.1 mL/只同源HPAIV DK/GZ/S4184/2017（H5N6）和同分支異源HPAIV DK/GD/S1110/2019（H5N6）、DK/GX/1/2018（H5N6）、DK/HuN/SE0110/2018（H5N6）株通過鼻腔途徑攻擊。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pCA-S4184 免疫后SPF 雞可以產(chǎn)生抵抗同源及同分支異源病毒攻擊的能力，對(duì)SPF 雞的保護(hù)率均可達(dá)100%。免疫持續(xù)期試驗(yàn)結(jié)果顯示，以15 μg/只免疫SPF 雞后HI 抗體持續(xù)期可達(dá)25 周以上，在加強(qiáng)免疫后至25 周，平均HI 抗體滴度保持在1∶11～1∶64；在免疫后第12 周和24 周的攻毒保護(hù)試驗(yàn)中，免疫雞均100%抵御了同源HPAIV DK/GZ/S4184/2017（H5N6）的攻擊。另外，重組質(zhì)粒pCA-S4184 以15 μg/只的劑量免疫后雖然能抵御同源以及同分支異源病毒的致死性攻擊，但平均HI 抗體水平在免疫后初期以及免疫后21 周左右均低于1∶16，考慮到HI 抗體水平檢測標(biāo)準(zhǔn)以及現(xiàn)地應(yīng)用的復(fù)雜性，臨床免疫效果可能會(huì)與實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果有一定差距，因此建議該重組質(zhì)粒的免疫劑量應(yīng)適當(dāng)提高。本研究結(jié)果表明，表達(dá)H5N6 亞型AIV HA 基因的重組質(zhì)粒pCA-S4184 免疫效果良好，有望成為預(yù)防我國當(dāng)前流行的H5 亞型2.3.4.4 分支HPAIV 的儲(chǔ)備DNA 疫苗。