基于單核細(xì)胞增生李斯特菌actA 基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)方法的建立

胡仲皓，單興根，何曉花，吳金節(jié)*，胡青海*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm），是一種主要且常見的食源性致病菌，也是一種重要的人畜共患病原菌。土壤、地表水、污水、廢水、植物、爛菜中均有該菌存在，所以動(dòng)物很容易食入該菌，并通過口腔-糞便等途徑傳播[1]。Lm是胞內(nèi)寄生菌，且能夠穿越家畜體內(nèi)的腸道屏障、血腦屏障、血胎屏障[2]，從而引發(fā)腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等特征癥狀的家畜李氏桿菌病，嚴(yán)重制約動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，因此建立一種快速、靈敏、特異的Lm 檢測(cè)方法對(duì)人畜公共衛(wèi)生安全尤為重要。

建立快速精準(zhǔn)檢測(cè)Lm 的技術(shù)，對(duì)及時(shí)掌握Lm的感染和流行情況具有重要意義，也有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)Lm 感染疫情，增強(qiáng)對(duì)重大Lm 感染疫情的預(yù)警預(yù)報(bào)能力，確保動(dòng)物及其產(chǎn)品安全。目前我國(guó)Lm 的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是將選擇培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)后的疑似菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等，但該方法耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，無法做到高通量檢測(cè)。近年來越來越多Lm 的檢測(cè)方法被研究出來，其中分子生物學(xué)方法因其特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn)應(yīng)用較為廣泛，如多重PCR 技術(shù)、熒光定量PCR 技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase polymerase amplification，RPA）、CRISPR 技術(shù)等。Notomi 等在2000 年發(fā)明了LAMP 技術(shù)[3]，該技術(shù)不需要高端昂貴的儀器設(shè)備、結(jié)果可視且檢測(cè)成本低，目前LAMP 檢測(cè)方法已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒以及寄生蟲等病原體的快速檢測(cè)[4-7]。

基于此，本研究以Lm 中核苷酸序列較為保守的毒力基因actA作為靶基因來建立LAMP 的檢測(cè)體系，該技術(shù)適用于基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，是人畜公共衛(wèi)生安全監(jiān)測(cè)的重要手段，為建立和完善食源性病原菌的監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料10×Isothermal Amp Buffer Ⅱ、MgSO4和Bst DNA 3.0 Polymerase 購(gòu)自NEB 公司；dNTP Mix 購(gòu)自Vazyme 公司；TIANamp Bacteria DNA Kit購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Green I（10 000×）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DS2000 DNA Marker 購(gòu)自東盛生物科技有限公司。

本研究使用的Lm LMF2365 和金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）ATCC 29213 由上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院索玉娟博士惠贈(zèng)；腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic E. coli）O157:H7 ATCC43889、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）SL7207、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）ATCC23715、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）SH01、空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）CJFX01、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）Aha01、副豬嗜血桿菌（Haemophilus suis）Ahh01、多殺性巴氏桿菌（Pasteutella multocida）Ahm03、 豬鏈球菌（Streptococcus suis）Ahs02、 豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）Ahe01 和支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica）Ahb01 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成采用BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）對(duì)LM19860 株actA基因序列（DQ309 883.2）進(jìn)行分析，并采用MSA Viewer 程序?qū)ctA基因（DQ309883.2）與BLAST 搜索到的其他菌株的同源序列進(jìn)行同源比對(duì)分析后，根據(jù)GenBank 中Lm 的actA基因序列（DQ309883.2），利用Primer Explorer V5 軟件（http://primerexplorer.jp/e/）在線設(shè)計(jì)多套LAMP 引物（表1）。同時(shí)利用Primer3 軟件（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)常規(guī)PCR 擴(kuò)增引物（表1）。引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

表1 LAMP和常規(guī)PCR擴(kuò)增引物Table 1 The primers used for LAMP and conventional PCR

1.3 LAMP 引物的篩選為評(píng)估設(shè)計(jì)的3 套引物用于LAMP 檢測(cè)的可行性，本研究以細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取Lm 的基因組DNA 作為陽性模板，以腸出血性大腸桿菌O157:H7、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、空腸彎曲菌基因組DNA 為陰性模板進(jìn)行LAMP 檢測(cè)。反應(yīng)體系如下：10×Isothermal Amp Buffer Ⅱ2.5 μL，MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL，dNTP Mix（10 mmol/L）3.5 μL，引物FIP 和BIP 各4 μL，引物F3 和B3 各0.5 μL（actA-1 至actA-3 的加樣體積均如此），Bst 3.0 DNA Ploymerase 1 μL，模板DNA 1 μL，加超純水至25 μL。65 ℃恒溫孵育1 h，85 ℃5 min。取10 μL 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 LAMP 反應(yīng)體系的優(yōu)化與可視化檢測(cè)以方法1.3 所述LAMP 體系建立基礎(chǔ)反應(yīng)體系，采用方陣法[7]分別優(yōu)化退火溫度（61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃）、MgSO4濃度（2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L）、內(nèi)引物FIP/BIP 和外引物（F3/B3）比例（4∶1、6∶1、8∶1），從而確定LAMP 最佳反應(yīng)條件。同時(shí)，以最優(yōu)反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增結(jié)束后取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物和上樣緩沖液混合后，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。剩余15 μL 反應(yīng)產(chǎn)物中加入1 μL SYBR Green I，肉眼或在365 nm 的紫外光下觀察結(jié)果。

1.5 特異性試驗(yàn)利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取Lm、腸出血性大腸桿菌O157:H7、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、空腸彎曲菌、胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、豬丹毒絲菌和支氣管敗血波氏桿菌的基因組作為模板，按優(yōu)化后的LAMP 方法擴(kuò)增，并進(jìn)行可視化檢測(cè)，評(píng)估本實(shí)驗(yàn)建立的Lm LAMP 方法的特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn)將濃度為4.7×109cfu/mL 的Lm 菌液采用0.9% NaCl 10 倍倍比稀釋（4.7×109cfu/mL～4.7×100cfu/mL）后，分別提取DNA 并按上述優(yōu)化后的LAMP 體系進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用PCR 引物F/R 進(jìn)行常規(guī)PCR 檢測(cè)，比較兩種方法的敏感性，評(píng)估本研究建立的LAMP 敏感性。

1.7 臨床樣品檢測(cè)將2020 年7 月～2021 年1 月從上海市18 個(gè)菜市場(chǎng)中采集11 個(gè)批次118 個(gè)豬肉樣品在低溫條件下快速運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后-20 ℃保存?zhèn)溆?。? g 豬肉樣品浸入TSA 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)10 h 后，取1 mL 菌液提取細(xì)菌基因組DNA，分別采用本研究建立的LAMP 反應(yīng)體系和常規(guī)PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)樣品按照現(xiàn)行食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)（GB4789.30-2016）中的檢測(cè)方法，先用PALCAM 培養(yǎng)基初篩，再進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)等鑒定Lm。比較3 種方法的檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算總體符合率。

2 結(jié) 果

2.1 靶基因選擇及特異性和保守性分析選取LM19860 株actA基因序列（DQ309883.2）進(jìn)行BLAST 分析，結(jié)果顯示采用Highly similar sequences（Megablast）程序時(shí)，有1 078 條核苷酸序列與其有同源性，且全部來自Lm。其中有actA基因完整ORF 的有611條，LM19860 株與其他610 株LmactA基因的同源性為94%～100%；當(dāng)采用More dissimilar sequences（Discontiguous megablast）程序BLAST 時(shí)，有1 085 條核苷酸序列與actA基因有同源性，除了1 078 條來自Lm外，有6 條長(zhǎng)度為115 bp～117 bp 的核苷酸序列來自西爾李斯特菌（Listeria seeligeri），與LM19860株actA基因片段同源性均為75%；另一條長(zhǎng)度為66 bp 的核苷酸序列來自綿羊李斯特菌（Listeria ivanovii），與LM19860 株actA基因片段同源性為73%。但這兩種菌株的同源性片段并不在本研究中LAMP 擴(kuò)增的核苷酸區(qū)域內(nèi)。上述結(jié)果表明actA基因作為檢測(cè)靶基因具有良好的特異性。

采用MSA Viewer 進(jìn)行多序列對(duì)比分析結(jié)果顯示，不同Lm 菌株的actA基因前300 bp 同源性高，因此應(yīng)選擇actA基因5'端300 bp 內(nèi)設(shè)計(jì)LAMP 引物。本研究設(shè)計(jì)的actA-3 引物組的擴(kuò)增片段位于actA基因（DQ309883.2）第59 nt～262 nt，在不同的Lm 菌株間僅存在極少數(shù)的堿基替代，其主要的堿基替代出現(xiàn)在第88 nt（內(nèi)引物FIP）、第245 nt（外引物B3）、在第153 nt、217 nt 和219 nt（內(nèi)引物BIP）。引物中少數(shù)堿基替代對(duì)LAMP 的擴(kuò)增反應(yīng)影響很小。

2.2 引物篩選結(jié)果以Lm 基因組作為陽性模板，其他病原菌的基因組和水作為陰性及空白對(duì)照，分別評(píng)估3 套引物的LAMP 擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果顯示，引物組actA-1 對(duì)各食源性致病菌模板無明顯擴(kuò)增條帶（圖1A）；引物組actA-2對(duì)腸出血性大腸桿菌O157:H7、鼠傷寒沙門氏菌的基因組產(chǎn)生擴(kuò)增，對(duì)剩余菌株模板無明顯擴(kuò)增條帶（圖1B）；引物組actA-3 作為檢測(cè)引物時(shí)，只有陽性模板Lm 基因組出現(xiàn)典型的梯形擴(kuò)增條帶，其他非Lm 菌株和水均無擴(kuò)增條帶（圖1C）。以上結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的actA-1 引物組不能實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增actA基因的目的；actA-2 引物組特異性差，無法用于Lm 的LAMP 檢測(cè)，而actA-3 引物組的特異性強(qiáng)，因此本研究選取actA-3 引物組作為L(zhǎng)m LAMP 檢測(cè)體系的引物。

圖1 actA-1（A）、actA-2（B）和actA-3（C）3組不同引物進(jìn)行LAMP反應(yīng)的結(jié)果Fig.1 Results of LAMP reaction with three different primers actA-1(A),actA-2(B)and actA-3(C)

2.3 LAMP 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果在LAMP 反應(yīng)體系中，經(jīng)過對(duì)反應(yīng)溫度、MgSO4濃度、內(nèi)外引物比例的篩選優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)溫度為64 ℃、最佳MgSO4濃度為6 mmol/L、最佳內(nèi)外引物比例為8∶1。在反應(yīng)體系中（等溫?cái)U(kuò)增之前）或在反應(yīng)結(jié)束后加入1 μL SYBR Green I，均能進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增結(jié)果的可視活檢測(cè)。

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果分別以Lm、腸出血性大腸桿菌O157:H7、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、空腸彎曲菌、胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、豬丹毒絲菌和支氣管敗血波氏桿菌的DNA 以及ddH2O 為模板，按優(yōu)化后的LAMP 方法擴(kuò)增，并進(jìn)行可視化檢測(cè)。結(jié)果顯示，僅Lm 出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，dd H2O 和其他12 個(gè)菌株均無明顯擴(kuò)增條帶（圖2A）；在肉眼觀察下只有Lm 對(duì)應(yīng)的反應(yīng)管呈現(xiàn)黃綠色（圖2B）；在365 nm 的紫外光觀察下只有Lm 對(duì)應(yīng)的反應(yīng)管發(fā)出綠色熒光（圖2C），ddH2O 和其他細(xì)菌反應(yīng)管無明顯的綠色熒光。結(jié)果表明，本研究建立的LAMP 檢測(cè)方法特異性較強(qiáng)。

圖2 LAMP的特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The specificity results of LAMP

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果提取10倍倍比稀釋后的Lm菌液基因組DNA（濃度為4.7×109cfu/mL～4.7×100cfu/mL），按優(yōu)化后的LAMP 方法進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，LAMP法檢測(cè)Lm 的下限為4.7×101cfu/mL（圖3A），而常規(guī)PCR 檢測(cè)Lm 的下限為4.7×103cfu/mL（圖3B）。LAMP方法比PCR 方法的敏感性高100 倍。結(jié)果表明，本研究建立的LAMP 方法敏感性較高。

圖3 LAMP（A）和常規(guī)PCR（B）敏感性試驗(yàn)結(jié)果的比較Fig.3 Comparison of the sensitivity of LAMP(A)and conventional PCR(B)

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果利用優(yōu)化后的LAMP 方法、常規(guī)PCR 方法和國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法對(duì)采集的118 份豬肉臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。LAMP 方法檢測(cè)結(jié)果顯示，除了Lm LMF2365 基因組DNA 陽性對(duì)照外，僅有9、12、43 樣品為陽性，即9、12、43 號(hào)的豬肉臨床樣品檢測(cè)到Lm，陽性率為2.54%（3/118），該結(jié)果與常規(guī)PCR 檢測(cè)結(jié)果、國(guó)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均一致，二者的總體符合率達(dá)100%。表明本研究建立的Lm LAMP 方法可以用于臨床樣品的檢測(cè)。

3 討 論

本研究曾嘗試采用hly基因作為靶基因來建立LAMP檢測(cè)方法，共設(shè)計(jì)了3套引物，但建立的LAMP方法均出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增。隨后本研究選擇核苷酸序列比hly基因要保守些的（作者采用BLAST 和MSA viewer 分析的結(jié)果）actA基因作為檢測(cè)靶基因，共設(shè)計(jì)了3套引物，結(jié)果基于actA-3引物組成功建立了Lm的LAMP檢測(cè)方法。這提示建立LAMP檢測(cè)方法過程中，靶基因的選擇和引物的設(shè)計(jì)同樣重要。

特異性和敏感性是評(píng)價(jià)食源性致病菌檢測(cè)方法的重要指標(biāo)。本研究使用其他常見的食源性致病菌和豬肉中常見的致病菌來進(jìn)行特異性分析，結(jié)果表明本研究建立的LAMP 檢測(cè)體系具有高度特異性。在敏感性方面，本研究建立的LAMP 檢測(cè)方法檢測(cè)下限為4.7×101cfu/mL。許龍巖等針對(duì)編碼溶血素的hly基因及內(nèi)化素InlA基因分別設(shè)計(jì)引物和TaqMan 探針，建立了Lm的熒光定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)Lm最低檢測(cè)限為2.5×102cfu/mL，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)約為20 h[8]。Garrido 等將RPA 技術(shù)與qPCR 結(jié)合，針對(duì)Lm 編碼溶血素的hly基因建立的檢測(cè)方法[9]，該方法25 g 樣品中對(duì)Lm的最低檢測(cè)限達(dá)到了6.3 cfu/mL，但該檢測(cè)方法需要昂貴的熒光定量PCR 檢測(cè)儀器和專業(yè)的操作人員，不便于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。賈甜甜針對(duì)Lmhly基因建立了最低檢測(cè)限為9.47×101cfu/mL 的LAMP 檢測(cè)體系[10]。Nathaniel 等針對(duì)Lm 編碼內(nèi)化素蛋白的lmo0753 基因建立了檢測(cè)下限為38 cfu/mL 的LAMP 檢測(cè)方法，其敏感性與本研究的檢測(cè)方法相近，但該方法未做到可視化檢測(cè)[11]。

隨著LAMP 擴(kuò)增的進(jìn)行，dNTP 會(huì)釋放焦磷酸根離子，與體系中的Mg2+離子形成焦磷酸鎂沉淀。一般情況下，白色沉淀與反應(yīng)液中的雙鏈DNA 含量成正比，因此有報(bào)道通過濁度儀檢測(cè)焦磷酸鎂的沉淀量來定性反應(yīng)程度[12]。但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中，一般焦磷酸鎂沉淀量產(chǎn)生較少，在檢測(cè)低濃度模板時(shí)難以觀察到。有研究者在反應(yīng)體系中加入鈣黃綠素，該指示劑能在Mg2+離子與焦磷酸根離子結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光[12]。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，體系中加入鈣黃綠素會(huì)導(dǎo)致LAMP 檢測(cè)的敏感性降低。本研究通過在反應(yīng)中加入SYBR Green I 核酸染料實(shí)現(xiàn)了可視化檢測(cè)，當(dāng)反應(yīng)為陽性結(jié)果時(shí)呈綠色伴有熒光，陰性結(jié)果時(shí)為橙色，且可減小開蓋時(shí)造成的氣溶膠污染。但使用SYBR Green I 對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求較高，引物二聚體也會(huì)和染料產(chǎn)生少量熒光，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13]。

建立Lm 快速檢測(cè)體系，是有效預(yù)防和控制食源性病原菌感染的重要基礎(chǔ)，有利于建立和完善食源性病原菌的監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，為國(guó)家制定食品安全政策、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)提供重要依據(jù)。