基于非洲豬瘟病毒E199L 蛋白間接ELISA 方法的建立

范婷婷，何希君,2，張險(xiǎn)峰,2*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所病原與病理形態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家動(dòng)物疫病防控高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由ASF 病毒（ASFV）引起的一種廣泛出血性、高度接觸傳播的豬烈性傳染病，所有品種和日齡的豬均可感染，家豬高度易感，發(fā)病率和死亡率最高可達(dá)100%，威脅著全球養(yǎng)豬業(yè)。自2018 年8 月在遼寧確診我國(guó)首例ASF 疫情以來(lái)，ASF 迅速在全國(guó)蔓延，到目前為止已經(jīng)給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。該病目前主要在歐洲、非洲及一些亞洲國(guó)家流行[1-2]。

ASFV 是一種有囊膜的復(fù)雜的核質(zhì)大DNA 病毒（NCLDV），也是目前唯一已知核酸為DNA 的蟲(chóng)媒病毒。ASFV 基因組結(jié)構(gòu)是對(duì)稱的二十面體，含有若干同心層，呈六邊形外觀，包括末端反向重復(fù)、末端交聯(lián)、中央保守區(qū)和基因組兩端的可變區(qū)[3-5]。全長(zhǎng)170 kb～190 kb 不等，含有150～167 個(gè)開(kāi)放閱讀框，可編碼上百種蛋白。病毒蛋白功能多樣，參與病毒形態(tài)發(fā)生、病毒復(fù)制、宿主免疫應(yīng)答等過(guò)程，還有多種病毒蛋白的功能未知[1-4]。鑒定參與宿主免疫應(yīng)答的病毒蛋白仍然是ASFV 研究中重要的任務(wù)之一。含有假定跨膜區(qū)的蛋白是重要關(guān)注點(diǎn)之一，因?yàn)樗鼈兛梢员徽系讲《玖Ｗ拥膬?nèi)膜或外膜和/或在感染細(xì)胞的表面表達(dá)。

ASFV E199L 蛋白是一種富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)多肽，定位于病毒的內(nèi)膜，是一種完整的跨膜蛋白，有良好的免疫原性[5-6]。本研究以ASFV Pig/HLJ/2018株基因組（MK333180.1）為模板，PCR 擴(kuò)增E199L 基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-E199L。利用IPTG 誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE 和western blot 鑒定后，利用該重組蛋白（rE199L）作為包被抗原，建立用于檢測(cè)ASFV E199L 蛋白抗體的間接ELISA 方法[7]。為ASFV 的早期檢測(cè)提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及血清大腸桿菌（E. coli）BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；pET-32a（+）由本實(shí)驗(yàn)室保存；ASFV Pig/HLJ/2018 株基因組從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所分離并保存的ASFV 中提?。慌R床樣品以及8 份ASFV 陽(yáng)性血清均由國(guó)家動(dòng)物疫病防控高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室提供；217 份ASFV 陰性SPF 豬血清來(lái)源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地的SPF 豬。豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）陽(yáng)性血清均本實(shí)驗(yàn)保存。196 份ASF 臨床豬血清樣品由哈爾濱獸醫(yī)研究所非洲專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供，為ASF 弱毒疫苗HLJ/18-7GD株[8]免疫兩次獲得的豬血清，兩次免疫間隔三周，從免疫開(kāi)始每隔5 d 采血一次，并分離血清，共采集了3 次。

1.2 主要試劑T4 DNA Ligase、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、DL2000 及DL10000 DNA Marker 均購(gòu)自TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I 和XhoI 購(gòu)自New England Biolabs 公司；BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；IPTG、PureLinkTMHiPure 質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自Invitrogen 公司；彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（10 ku～180 ku）購(gòu)自GenStar 公司；Ni 層析介質(zhì)（NTA）重力預(yù)裝柱套裝購(gòu)自博奧龍公司；His-Tag 鼠源單克隆抗體（MAb）購(gòu)自Proteintech 公司；ASFV 阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自ABM公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 中ASFV Pig/HLJ/2018株（MK333180.1）E199L 基因序列，結(jié)合pET-32a（+）載體的多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，上游引物E199LF：5'-CGGAATTCCGTTGCCCGCTTAAAAATTG-3'/下游引物E199L-R：5'-CCCTCGAGGGTCGGTGATAGG TTGAATA-3'，下劃線分別為EcoR I、XhoI 酶切位點(diǎn)，由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與重組E199L蛋白(rE199L)的表達(dá)與鑒定以Pig/HLJ/2018 株基因組為模板，以E199L-F/E199L-R 引物經(jīng)PCR 擴(kuò)增E199L 基因片段，經(jīng)回收純化后，克隆于pET-32a（+）載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒并經(jīng)菌液PCR鑒定后由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序鑒定，正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-E199L。將pET-32a-E199L 轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600nm值為0.6時(shí)，分別加入終濃度為0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L的IPTG，分別于37 ℃、25 ℃、17 ℃誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)設(shè)置pET-32a（+）載體轉(zhuǎn)化的菌作為陰性對(duì)照，培養(yǎng)12 h 后收集菌液。離心收集菌體沉淀，PBS 洗滌后重懸，超聲裂解破碎后分離上清與沉淀，通過(guò)12%SDS-PAGE 檢測(cè)蛋白的表達(dá)及表達(dá)形式。按上述確定的蛋白表達(dá)條件大量誘導(dǎo)rE199L 的表達(dá)。利用Ni層析介質(zhì)（NTA）重力預(yù)裝柱摸索蛋白純化的條件，并大量純化蛋白。以His-標(biāo)記小鼠MAb（1∶5 000）為一抗，兔抗小鼠HRP-IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定rE199L 蛋白的反應(yīng)原性。

1.5 間接ELISA 方法反應(yīng)條件的優(yōu)化采用矩陣法，按照間接ELISA 常規(guī)程序分別對(duì)純化的rE199L蛋白包被濃度（1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、8.0 μg/mL、16.0 μg/mL）、ASFV 陽(yáng)性豬血清和陰性豬血清稀釋倍數(shù)（1∶10、1∶50、1∶100、1∶200）、封閉液（1%BSA、2%BSA、5%脫脂乳、5%胎牛血清）、封閉時(shí)間（30 min、45 min、60 min、75 min）、兔抗豬HRP-IgG（1∶1 000、1∶5 000、1∶7 500、1∶1 0000）、孵育時(shí)間（30 min、45 min、60 min、75 min）等進(jìn)行優(yōu)化，確定該方法的最佳反應(yīng)條件。

1.6 臨界值的確定按照上述優(yōu)化的程序檢測(cè)217份豬陰性血清，測(cè)定其OD450nm值，計(jì)算平均值ˉx和標(biāo)準(zhǔn)方差SD，將ˉx+3s作為臨界值，OD450nm值大于或等于臨界值判定為陽(yáng)性，OD450nm值小于臨界值判定為陰性。

1.7 特異性試驗(yàn)利用上述優(yōu)化的間接ELISA 方法分別對(duì)PRRSV、PEDV、CSFV、PCV、PPV、PRV、ASFV 陽(yáng)性豬血清進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)ASFV 陰性豬血清作為陰性對(duì)照，每種血清設(shè)置2 個(gè)重復(fù)，評(píng)價(jià)ELISA檢測(cè)方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn)利用上述優(yōu)化的間接ELISA 方法對(duì)10 倍倍比稀釋的ASFV 陽(yáng)性豬血清（1∶100～1∶6 400）后進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)血清樣品設(shè)置2 個(gè)重復(fù)，確定陽(yáng)性血清的最高稀釋度，評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)選取同一批次包被的3 塊酶標(biāo)板，利用建立的間接ELISA 方法檢測(cè)8 份ASFV 陽(yáng)性豬血清，每種樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算其批內(nèi)變異系數(shù)（CV），評(píng)價(jià)該方法的批內(nèi)重復(fù)性。選取3 塊不同批次包被的酶標(biāo)板，利用該方法檢測(cè)上述8 份ASFV 陽(yáng)性豬血清，每種樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算其批間變異系數(shù)（CV），評(píng)價(jià)該方法的批間重復(fù)性。

1.10 臨床樣品檢測(cè)采用建立的ELISA 方法檢測(cè)196 份臨床豬血清樣品，并與美國(guó)biostone ASFV 阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果相比較，并計(jì)算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果以ASFV Pig/HLJ/2018 株基因組作為模板，利用相應(yīng)引物經(jīng)PCR 擴(kuò)增E199L 基因片段，結(jié)果顯示，獲得與預(yù)期大小相符的目的片段（圖1A）。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a-E199L 經(jīng)雙酶切（圖1B）和測(cè)序鑒定均正確。

圖1 E199L基因的PCR擴(kuò)增（A）及重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定（B）結(jié)果Fig.1 PCR amplification(A)and Enzyme digestion analysis(B)of E199L gene

2.2 rE199L 的表達(dá)、純化及鑒定結(jié)果重組菌pET-32a-E199L/BL21（DE3）經(jīng)不同終濃度的IPTG 在不同溫度誘導(dǎo)后的SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示，E199L 蛋白主要以可溶性蛋白形式表達(dá)，在25 ℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的rE199L表達(dá)量較多（圖2A～圖2C）。通過(guò)帶有His 標(biāo)簽的Ni 層析介質(zhì)（NTA）重力預(yù)裝柱純化蛋白，經(jīng)His 標(biāo)簽純化后的蛋白進(jìn)行western blot 鑒定，結(jié)果顯示在22 ku 有特異性條帶（圖2D），表明E199L 蛋白具有較好的反應(yīng)原性。

圖2 rE199L表達(dá)的SDS-PAGE（A、B、C）及其純化的western blot（D）鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant E199L protein by SDSPAGE(A,B,C)and western blot(D)

2.3 間接ELISA 方法的優(yōu)化采用矩陣滴定法優(yōu)化各反應(yīng)條件結(jié)果如表1。

表1 間接ELISA方法反應(yīng)條件的優(yōu)化Table 1 Optimization of reaction conditions for indirect ELISA

2.4 間接ELISA 方法臨界值的確定利用上述優(yōu)化的間接ELISA 方法檢測(cè)217 份ASFV 陰性豬血清，測(cè)定其OD450nm值，將ˉx+3s作為陰、陽(yáng)性血清的臨界值，結(jié)果顯示OD450nm值均介于0.038～0.696（圖3）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，樣品OD450nm的ˉx為0.301，SD 為0.041，即當(dāng)待檢樣品的OD450nm值≥0.424 時(shí)，判定樣品為陽(yáng)性，當(dāng)待檢樣品的OD450nm值＜0.424 時(shí)，判定樣品為陰性。

圖3 陰性樣品結(jié)果的正態(tài)分布圖Fig.3 Normal distribution diagram of negative samples

2.5 間接ELISA方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果利用優(yōu)化的間接ELISA 方法檢測(cè)PRRSV、PEDV、CSFV、PCV、PPV、PRV 及ASFV 陰、陽(yáng)性豬血清，每種血清2 次重復(fù)，結(jié)果顯示，只有ASFV 陽(yáng)性豬血清的OD450nm值大于0.424，其他血清樣品的OD450nm值均小于0.424（表2），表明建立的間接ELISA 方法特異性較強(qiáng)。

表2 間接ELISA方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Specificity test of the indirect ELISA

2.6 間接ELISA 方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果將ASFV陽(yáng)性豬血清從1∶100 開(kāi)始10 倍倍比稀釋?zhuān)脙?yōu)化的間接ELISA 方法檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定陽(yáng)性血清的最大稀釋度，結(jié)果顯示，當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋度為1∶1 600，檢測(cè)的OD450nm值仍大于0.424（表3），表明該方法能夠檢測(cè)ASFV 陽(yáng)性血清的最大稀釋度為1∶1 600，敏感性較高。

表3 間接ELISA方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Sensitivity test of the indirect ELISA

2.7 間接ELISA 方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果選取同一批次包被的酶標(biāo)板，采用建立的間接ELISA 方法檢測(cè)8 份ASFV 陽(yáng)性豬血清，每份樣品3 次重復(fù)，計(jì)算其批內(nèi)變異系數(shù)（CV）；選取不同批次包被的酶標(biāo)板，采用建立的間接ELISA 方法檢測(cè)上述血清樣品，計(jì)算批間變異系數(shù)（CV）。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均＜10%（表4）。表明建立的間接ELISA方法重復(fù)性較好。

表4 間接ELISA方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Repeatability test of the indirect ELISA

2.8 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果采用本研究建立的間接ELISA 方法與美國(guó)biostone 非洲豬瘟阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒（10057-02/05）同時(shí)檢測(cè)196 份豬血清。本研究建立的間接ELISA 檢測(cè)結(jié)果為：陽(yáng)性樣品175 份，陰性樣品21 份，陽(yáng)性檢出率為89.3%；且在免疫后7 d 就檢測(cè)出了相應(yīng)抗體。采用進(jìn)口商品化試劑盒檢測(cè)結(jié)果為：陽(yáng)性樣品178 份，陰性樣品18 份，陽(yáng)性檢出率為90.8%；經(jīng)計(jì)算二者符合率為98.3%。表明本實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA 方法與商品化試劑盒的符合率較高，可以用于臨床樣品的檢測(cè)。

3 討 論

ASF 自1921 年在肯尼亞地區(qū)首次報(bào)道至今已有一個(gè)世紀(jì)的歷史，長(zhǎng)距離、跨區(qū)域傳播至多個(gè)國(guó)家，并給這些國(guó)家的生豬及相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的打擊[1]。2016 年以來(lái)，ASF 疫情顯著增加，2018 年，ASF 傳入中國(guó)，并迅速蔓延到全國(guó)大部分地區(qū)。截至目前，尚無(wú)商品化疫苗用于ASF 的防控。因而建立能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)ASFV 的方法對(duì)于ASF 疫情防控非常重要。目前主要有p72、p54 和p30 等蛋白可作為ASFV 檢測(cè)方法的靶抗原。而最近對(duì)我國(guó)部分地區(qū)的ASF 流行病學(xué)檢測(cè)和病原學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)了ASF 基因II 型自然變異流行株的出現(xiàn)[9]，大大增加了該病早期診斷的難度，為我國(guó)ASF 防控帶來(lái)全新的挑戰(zhàn)。探尋ASFV 血清學(xué)的候選診斷抗原并以此建立相應(yīng)的檢測(cè)方法，有助于提高ASFV 檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究選擇的E199L 結(jié)構(gòu)蛋白是定位于ASFV 內(nèi)膜的一種I 型跨膜多肽，含有分子內(nèi)二硫鍵，在病毒內(nèi)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，E199L 蛋白缺陷的病毒顆粒不能實(shí)現(xiàn)膜融合和基因組核心釋放到細(xì)胞質(zhì)中的過(guò)程，使得病毒顆粒在宿主細(xì)胞溶酶體樣結(jié)構(gòu)中累積。此外，缺陷E199L 蛋白的病毒顆粒vE199Li 感染的細(xì)胞不表達(dá)早期（p32/pCP204L）或晚期（p72）標(biāo)記的病毒蛋白[6]。上述結(jié)果表明，E199L蛋白是ASFV 感染早期所必需的。有研究表明，ASFV E199L 蛋白可以激活NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）和干擾素誘導(dǎo)蛋白2（AIM2）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，推測(cè)其可能在ASFV 的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[10]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ASFV 通過(guò)調(diào)節(jié)促炎分子和細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)逃避宿主的免疫監(jiān)測(cè)[11-13]。表明E199L 可能參與病毒感染后的炎性反應(yīng)而逃避宿主的免疫防御。豬感染ASFV 后的7 d～10 d 內(nèi)可檢測(cè)到E199L 抗體，表明E199L 可以用于ASFV 的早期檢測(cè)。綜上所述，E199L 在ASFV 復(fù)制早期及免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用，在原核表達(dá)系統(tǒng)中可以穩(wěn)定表達(dá)，且在豬中可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，表明E199L 可以作為ASFV 血清學(xué)檢測(cè)及其疫苗研發(fā)的候選抗原。

本研究在原核系統(tǒng)中表達(dá)了ASFV E199L 蛋白并建立了檢測(cè)其抗體的間接ELISA 方法。建立的間接ELISA 檢測(cè)方法具有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性，對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果與ASFV 阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒（p54）檢測(cè)結(jié)果的符合率較高。目前尚無(wú)針對(duì)E199L 蛋白的商品化試劑盒，而由哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司研發(fā)的p72 間接ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒的敏感性為1∶1 600，與本研究建立的E199L 間接ELISA 方法的敏感性一致，說(shuō)明基于E199L 建立的間接ELISA 方法的敏感性已達(dá)到商品化試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)，可以為ASFV 的早期檢測(cè)提供更多方法的選擇。