河南地區(qū)豬源沙門菌血清型4,[5],12:i:-的分離鑒定及耐藥性分析

蔣增海，王成龍，馮蘭珠，胡敏杰，鄧同煒，徐耀輝，何啟蓋

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046;3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室，湖北 武漢 430070）

沙門菌血清型4,[5],12:i:-，缺乏2 相鞭毛抗原表達(dá)，是一種鼠傷寒單相變種[1]，也是近年來感染人類最普遍的沙門菌血清型之一[2]。在20 世紀(jì)90 年代中期以前，很少分離到沙門菌血清型4,[5],12:i:-。然而，在過去的十多年里，沙門菌血清型4,[5],12:i:-已經(jīng)成為歐洲和美國主要的公共衛(wèi)生威脅，在全球多個國家的檢出率大幅度增加，并引起多次危害嚴(yán)重的沙門菌病疫情的暴發(fā)[3]。最近研究表明，沙門菌血清型4,[5],12:i:-已經(jīng)在河南省病人中的流行，首次超過鼠傷寒沙門菌，排在第二位，僅次于腸炎沙門菌[4]。

美國愛荷華州獸醫(yī)診斷實驗室檢測結(jié)果表明，自從2014 年開始，沙門菌血清型4,[5],12:i:-已經(jīng)成為從豬臨床樣品中鑒定出的最主要血清型，而鼠傷寒沙門菌成為排在第二位的血清型[5]；通過豬臨床病例分析，已經(jīng)證實沙門菌血清型4,[5],12:i:-的陽性分離與其出現(xiàn)腸道沙門菌病病變之間呈強正相關(guān)，表明該菌型具有與鼠傷寒沙門菌相似的致病潛力[6]，但是沙門菌血清型4,[5],12:i:-在我國豬群中的感染情況尚無相關(guān)報道。為了調(diào)查沙門菌血清型4,[5],12:i:-在河南地區(qū)豬的流行狀況，本研究于2015 年9 月～2018 年12 月，從河南地區(qū)豬場送檢的63 個臨床病例中，分別采集肺、心血、肝等病料樣品，進(jìn)行沙門菌的分離鑒定、血清型分型和耐藥性檢測。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源2015 年9 月～2018 年12 月，從河南鄭州、新鄉(xiāng)、鶴壁、許昌、商丘、平頂山、周口、洛陽、開封、駐馬店、南陽和漯河等地送檢的病豬或死豬，采集肺、心血、肝等病料樣品，進(jìn)行沙門菌的分離鑒定。

1.2 主要試劑胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）購自美國BD 公司；S.S 瓊脂購自北京奧博星生物有限公司；5%鮮血瓊脂平板購自江門市凱林貿(mào)易有限公司；MH 肉湯購自英國Oxoid 公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購自索寶來公司；PremixTaqTM、DL2000 DNA Marker 購自TaKaRa公司；核酸染料購自天恩澤公司；快速革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；沙門菌屬診斷陽性血清購自寧波天潤生物藥物有限公司；鼠傷寒沙門菌鞭毛抗原誘導(dǎo)血清購自日本生研株式會社；各種抗菌藥物均由浙江大學(xué)樂敏教授惠贈。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)在嚴(yán)格無菌操作條件下，采集病豬或死豬的肺、心血、肝等病料樣品，分區(qū)劃線接種于TSA 平板（加有5%犢牛血清和0.01% NAD），37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h～24 h，挑取疑似為沙門菌的單菌落（要求在第一代平板上菌落生長均勻一致，無其他雜菌生長，保證為單一病原菌的感染），分別劃線接種于血瓊脂平板、S.S瓊脂平板，如此純化2～3代；再挑取純化后的單菌落，接種于TSB肉湯，37 ℃搖床培養(yǎng)8 h～12 h，利用滅菌的20%甘油溶液，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。挑取在S.S 瓊脂平板上生長為均勻一致的疑似沙門菌的單菌落，進(jìn)行抹片，火焰固定后，采用革蘭氏染色液染色，在油鏡下觀察分離細(xì)菌的形態(tài)特征。

1.4 分離菌的PCR 鑒定挑取純化后的疑似沙門菌的單菌落，接種于5 mL TSB 肉湯，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)4 h～8 h，取1 mL 菌液經(jīng)煮沸法提取分離細(xì)菌的DNA 作為模板，利用文獻(xiàn)[7]的沙門菌腸毒素Stn基因的引物（Stn-F: 5'-CTTTGGTCGTAAAATAAGGC G-3'/Stn-R: 5'-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3'）經(jīng)PCR 鑒定。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94 ℃1 min，55 ℃45 s，72 ℃30 s，共30 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 分離菌的血清分型和沙門菌血清型4,[5],12:i:-的鑒定采用玻片凝集法對分離的沙門菌進(jìn)行血清分型，以生理鹽水為陰性對照，具體操作按照說明進(jìn)行，根據(jù)Kauffmann-White 抗原表[8]檢索沙門菌分離菌株的血清型，另外根據(jù)分離菌株的部分生化特征和培養(yǎng)特征，進(jìn)一步確認(rèn)某些分離菌株是豬霍亂沙門菌，還是豬霍亂沙門菌孔成道夫變種。對于初步鑒定為沙門菌血清型4,[5],12:i:-的菌株，通過鞭毛相抗原誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法[9]，進(jìn)一步驗證第2 相鞭毛抗原表達(dá)的缺失，即利用沙門菌1 相鞭毛i 抗原的陽性血清與被檢菌株共培養(yǎng)，通過搭建紙橋的方法，被檢菌通過紙橋遷移后，生長在橋的另一端；這些生長在紙橋另一端的被檢菌，就可能會發(fā)生鞭毛相抗原的轉(zhuǎn)化，再利用血清型方法，進(jìn)一步鑒定其2 相鞭毛抗原表達(dá)是否缺失。

通過Tennant 等建立的雙重PCR 法[10]，進(jìn)一步驗證分離菌株的血清型。如果分離菌株為鼠傷寒沙門菌，或者沙門菌血清型4,[5],12:i:-，則均能擴增出長度為1 000 bp 的IS200 基因的目的條帶，其他沙門菌則擴增出250 bp 的IS200 基因的目的條帶和1 380 bp 的第2 相鞭毛基因（fljB）條帶；如果分離菌株為鼠傷寒沙門菌，也能夠擴增出1 380 bp 的fljB基因條帶，而沙門菌血清型4,[5],12:i:-由于缺乏fljB基因，不能擴增出1 380 bp 的fljB基因條帶。

1.6 藥敏試驗選取氨芐西林（AMP）、阿莫西林/克拉維素（AMC）、頭孢噻呋（EFT）、頭孢曲松（CRO）、頭孢西?。–X）、慶大霉素（GEN）、卡那霉素（K）、鏈霉素（STR）、四環(huán)素（TE）、環(huán)丙沙星（CIP）、萘啶酸（NAL）、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶（SXT）、磺胺甲基異惡唑（SF）、粘桿菌素（CT）、阿奇霉素（AZI）、 氯霉素（CHL）16 種藥物，以大腸桿菌（ATCC25922）為質(zhì)控菌株，依據(jù)參考文獻(xiàn)[11-12]，采用微量稀釋法檢測分離菌對上述16 種藥物的最低抑菌濃度（MIC），測定分離菌株的耐藥性。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果針對送檢的63 個仔豬病例，分別采集肺、心血、肝等病料樣品，劃線接種于TSA 平板，經(jīng)24 h～48 h 培養(yǎng)，在TSA 平板上生長出圓形、濕潤、半透明、直徑約1 mm～2 mm大小一致的菌落（圖1A）；在血瓊脂平板上則生長為無色透明、圓形、邊緣整齊、濕潤的大小約為0.5 mm～2 mm菌落，且無溶血現(xiàn)象；在S.S 瓊脂平板上生長為中央有黑心的濕潤圓形菌落（圖1B）。分離菌通過革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察，均為革蘭氏陰性、短小、中等大小桿菌。上述結(jié)果初步表明，從63個送檢仔豬病例的病料樣品中共分離到6 株疑似沙門菌，陽性分離率為9.52%（6/63），分別命名為Sep1、Sq2N、Qxo1L、Xinmi、SwG、Pyx（表1）。

圖1 分離菌株菌落生長特征Fig.1 Colonial characteristics of the isolates

2.2 分離菌的PCR 鑒定結(jié)果采用水煮法，提取分離菌株DNA 作為模板，PCR 擴增沙門菌屬腸毒素基因stn。結(jié)果顯示，擴增出約為260 bp 的目的片段，與預(yù)期擴增結(jié)果一致（圖2），表明6 株分離菌均為沙門菌。

圖2 沙門菌的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification results of Salmonella isolates

2.3 分離菌的血清分型和沙門菌血清型4,[5],12:i:-的鑒定結(jié)果通過玻片凝集法血清分型、部分生化特征及生長特征和2 相鞭毛抗原誘導(dǎo)方法鑒定分離菌的血清型。結(jié)果顯示，分離菌Sep1為豬霍亂沙門菌孔成道夫變種，分離菌株Qxo1L、Pyx 為豬霍亂沙門菌，分離菌Sq2N、Xinmi、SwG 為沙門菌血清型4,[5],12:i:-（表1）。通過Tennant等建立的雙重PCR法，對分離菌進(jìn)一步鑒定，結(jié)果顯示，分離菌株Sq2N、Xinmi、SwG 僅可擴增出長度為1 000 bp 的IS200 目的條帶，不能擴增出1 380 bp 的fljB基因條帶（圖3），表明分離菌株Sq2N、Xinmi、SwG 均為fljB基因陰性菌株，進(jìn)一步確定分離菌株Sq2N、Xinmi 、SwG 為沙門菌血清型4,[5],12:i:-。

表1 豬源沙門菌分離菌株的相關(guān)信息Table 1 Information on Salmonella isolates from pigs

圖3 沙門菌血清型4,[5],12:i:-的雙重PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of Salmonella serotype 4,[5],12:i:-isolates using duplex PCR

2.4 藥敏試驗結(jié)果采用微量稀釋方法進(jìn)行沙門菌分離菌的藥敏試驗。結(jié)果顯示，分離的沙門菌對氨芐青霉素、磺胺甲基異惡唑、萘啶酸和氯霉素均耐藥，呈多重耐藥表型，其中沙門菌血清型4,[5],12:i:-分離菌對卡那霉素、慶大霉素、阿奇霉素、四環(huán)素均耐藥，而對卡那霉素、慶大霉素、阿奇霉素、四環(huán)素耐藥的豬霍亂沙門菌孔成道夫變種和豬霍亂沙門菌分離菌的菌株數(shù)分別為0、0、0和2株（表2）。表明沙門菌血清型4,[5],12:i:-分離菌比豬霍亂沙門菌孔成道夫變種和豬霍亂沙門菌分離菌對上述這4 種藥物的耐藥性更強。藥敏試驗結(jié)果還顯示，分離的豬源沙門菌對頭孢曲松、頭孢西丁等人類專用藥均敏感。表明，臨床上豬源沙門菌對某些常用獸藥如氨芐青霉素、磺胺甲基異惡唑等的耐藥性比某些人類專用藥物如頭孢曲松等的耐藥性更強，因此注意防范人類專用抗菌藥物在動物上的使用，以免耐藥菌株的產(chǎn)生。

表2 分離沙門菌的藥敏試驗結(jié)果Table 2 Results of drug sensitivity test for Salmonella isolates

3 討 論

豬沙門菌病，又稱為豬副傷寒，其主要病原有豬霍亂沙門菌、豬傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、德爾卑沙門菌等[13]。本研究的沙門菌陽性病豬表現(xiàn)為高熱，排稀便，消瘦，皮膚出血，呼吸困難等，甚至死亡，剖檢病變主要是淋巴結(jié)腫大、出血，有的病例肝臟呈白色壞死小點，藥物治療效果不佳，主要是外購仔豬、季節(jié)交替天氣突變等多發(fā)（文中未顯示相關(guān)信息），符合豬沙門菌病發(fā)病癥狀和流行特點，這些特征對于診斷豬沙門菌病具有參考依據(jù)。本研究從臨床送檢63 病例中，共分離到6 株沙門菌，陽性分離率為9.52%，其中3 株為沙門菌血清型4,[5],12:i:-，另外3 株為豬霍亂沙門菌及豬霍亂沙門菌孔成道夫變種，第一次證明了沙門菌血清型4,[5],12:i:-在我國豬病臨床上的流行，且為沙門菌感染的主要血清型。

大多數(shù)沙門菌是借助于周生的鞭毛才能運動，這些鞭毛是由細(xì)菌染色體上的兩種不同鞭毛蛋白基因—fliC和fljB分別編碼，其中fliC基因表達(dá)產(chǎn)物是1 相鞭毛抗原，fljB基因表達(dá)產(chǎn)物是2 相鞭毛抗原[2]。本研究通過Tennant 等建立的雙重PCR 擴增結(jié)果顯示，血清分型鑒定為沙門菌血清型4,[5],12:i:-菌株，均未能擴增出1 380 bp 的fljB基因條帶，表明這些分離菌株缺乏2 相鞭毛抗原，是進(jìn)一步對血清學(xué)分型方法正確性的驗證。

雖然，我國學(xué)者已經(jīng)報道沙門菌血清型4,[5],12:i:-在病人、食品中的流行，但目前還沒有沙門菌血清型4,[5],12:i:-在我國病豬中流行的相關(guān)文獻(xiàn)報道。Liang 等報道，從廣東地區(qū)40 572 位腹瀉病人糞便樣品中，分離獲得沙門菌1 826 株，其中鼠傷寒沙門菌占30%（550/1 826），排在第一，沙門菌血清型4,[5],12:i:-占14%（254/1826）超過腸炎沙門菌13%（245/1 826），排在第二位[14]。Yang 等首次報道沙門菌血清型4,[5],12:i:-在我國食品中的存在[15]。Jiang 等從1441 份豬肉、豬肝和豬膽汁樣品中共分離到219株沙門菌，其中沙門菌血清型4,[5],12:i:-超過鼠傷寒沙門菌，排在第4 位[16]。

沙門菌血清型4,[5],12:i:-在進(jìn)化過程中，產(chǎn)生了嚴(yán)重的多重耐藥（Multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象，其耐藥菌株在全球多個國家被報道，該菌對氨芐西林（A）、氯霉素（C）、鏈霉素（S）、卡那霉素（K）、磺胺甲基異惡唑（Su）、四環(huán)素（T）等均表現(xiàn)不同的敏感性，產(chǎn)生泛耐藥和多重耐藥[3]。沙門菌血清型4,[5],12:i:-，通過2 相鞭毛抗原表達(dá)的缺失，進(jìn)化為有利于獲取各種耐藥基因[4]，可能有助于該菌在歐洲豬場和生產(chǎn)鏈中廣泛的傳播。本研究從63 個豬病例中，共分離到6 株沙門菌，其中3 株沙門菌血清型4,[5],12:i:-顯得更耐藥，均呈多重耐藥性，表明該種沙門菌血清型之所以能夠廣泛傳播和流行，可能與其嚴(yán)重的耐藥性有一定關(guān)系。

沙門菌病是重要的人畜共患病，嚴(yán)重危害人類健康和畜禽養(yǎng)殖業(yè)。該病原沙門菌屬有超過2 500種已知的血清型沙門菌，這些血清型菌的致病性與其宿主特異性不一[17]。本研究表明沙門菌血清型4,[5],12:i:-對仔豬具有一定的致病性，導(dǎo)致典型的豬沙門菌病，為主要流行血清型，且具有嚴(yán)重耐藥性，造成豬病臨床用藥治療失敗。另外，如果該種血清型沙門菌通過病豬與人類接觸，或者食物鏈傳播，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在威脅，應(yīng)引起重視。