結(jié)核性腦膜炎患者血清神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1與轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白的表達及臨床意義研究

吳云虹，周少瓏*，王景，蔡奕秋，林雅明

結(jié)核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是肺外結(jié)核疾病中嚴(yán)重的類型之一，由結(jié)核分枝桿菌感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起，可導(dǎo)致腦膜、脈絡(luò)叢和室管膜炎性反應(yīng)、腦積水、顱內(nèi)壓增高甚至腦疝，臨床病死率高，存活者易遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［1］。TBM 起病隱匿，病程長，癥狀輕重不一，臨床診斷和治療困難，早期發(fā)現(xiàn)和診斷是改善TBM 預(yù)后的關(guān)鍵［2］。神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1（neural cell adhesion molecule 1，NCAM1）是免疫球蛋白分子超家族中的細(xì)胞黏附家族分子，主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的功能和神經(jīng)元遷移以及神經(jīng)損傷后的突觸重組，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病存在密切關(guān)系［3］。轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）是一種甲狀腺激素結(jié)合蛋白，可將甲狀腺素從血液輸送到大腦，TTR 功能異?？蓪?dǎo)致心肌病、自主神經(jīng)疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］。而NCAM1、TTR 與TBM 是否存在關(guān)聯(lián)尚不完全清楚。本研究擬探討NCAM1、TTR 與TBM 的關(guān)系，旨在為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017 年3 月至2020 年12 月三亞市人民醫(yī)院和三亞市中心醫(yī)院收治的114 例TBM 患者為TBM 組，其中男67 例、女47 例，年齡27～46 歲，平均年齡（35.3±7.0）歲。選擇同期于三亞市人民醫(yī)院和三亞市中心醫(yī)院體檢中心體檢的46 例健康志愿者為對照組，其中男29 例、女17 例，年齡26～48 歲，平均年齡（35.3±7.1）歲。兩組均排除神經(jīng)系統(tǒng)疾病、顱內(nèi)感染、顱內(nèi)腫瘤等疾病。TBM 組和對照組的性別構(gòu)成、平均年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.249，t=0.033，P>0.05）。

1.2 TBM 患者納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《內(nèi)科學(xué)》［5］中的腦膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）腦脊液常規(guī)培養(yǎng)分離出結(jié)核分枝桿菌［6］；（3）年齡18 周歲以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）細(xì)菌、病毒性腦膜炎；（2）癲癇、腦梗死、腦出血；（3）阿爾茨海默病、帕金森、血管性癡呆等；（4）腦膜癌??；（5）隨訪失聯(lián)。

1.3 TBM 患者分期 根據(jù)英國醫(yī)學(xué)研究理事會（MRC）分期標(biāo)準(zhǔn)［7］，將患者分為Ⅰ期（無局灶神經(jīng)系統(tǒng)損傷體征）31 例、Ⅱ期（腦膜刺激征、輕度感覺和運動功能異常）45 例、Ⅲ期（驚厥或抽搐、昏睡或昏迷）38 例。本研究經(jīng)三亞市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：201711053）。TBM 組患者或其家屬及對照組均對本研究知情同意并簽署同意書。

1.4 實驗室檢查 TBM 組在入組當(dāng)日（基線）、入院7 d、入院14 d、隨訪1 個月、隨訪6 個月、隨訪1 年時分別采集靜脈血、腦脊液。對照組在體檢當(dāng)日（基線）僅采集靜脈血。干燥試管（3 ml）血標(biāo)本室溫下靜置30 min 后取上清液離心（離心半徑13.5 cm，轉(zhuǎn)速 2 000 r/min）10 min，收集血清于-80 ℃冷凍保存?zhèn)錂z，抗凝試管標(biāo)本混勻后直接上機檢測。腦脊液收集于專用標(biāo)本瓶待檢。取血清樣本復(fù)溶，采用Multiskan FC 酶標(biāo)儀（美國賽默飛公司）、酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清NCAM1、TTR 水平，試劑盒購自美國賽默飛公司。DxH 800 全自動血細(xì)胞分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）檢測外周血白細(xì)胞計數(shù)、腦脊液有核細(xì)胞數(shù)、有核細(xì)胞/單核細(xì)胞比值。采用DxC 800 全自動生化儀系統(tǒng)（美國貝克曼庫爾特公司）檢測血清白蛋白、血鈉、血鉀水平。

1.5 觀察指標(biāo) 收集TBM 組年齡、性別、合并疾?。ㄌ悄虿　滩?、肺結(jié)核）、既往病史（結(jié)核患者接觸史、結(jié)核病史）、入院癥狀（體質(zhì)量減輕、意識改變、癲癇、認(rèn)知功能障礙）、入院生命體征（心率、呼吸、收縮壓和舒張壓）、入院體格檢查（顱神經(jīng)麻痹、腦膜刺激征、外周神經(jīng)功能異常）、影像學(xué)檢查（腦積水、腦梗死病灶、結(jié)核瘤）、MRC 分期、住院時間、發(fā)病至抗結(jié)核治療時間、和實驗室檢查指標(biāo)。

TBM 組患者均接受抗結(jié)核治療，治療結(jié)束后隨訪1 年，根據(jù)改良Rankin 量表（Modified Rankin Scale，mRS）［8］評估神經(jīng)預(yù)后：0 分，完全無遺留癥狀；1 分，有遺留癥狀，但無功能障礙；2 分，遺留輕度殘疾；3 分，中度殘疾；4 分，中重度殘疾；5 分，重度殘疾；6 分，死亡。0～2 分為預(yù)后良好（63 例），≥3 分為預(yù)后不良（51 例）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，三組間比較采用單因素方差分析，重復(fù)測量數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量方差分析。偏態(tài)計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。計數(shù)資料以相對數(shù)表示，采用χ2檢驗。采用多因素Logistic 回歸分析探討TBM預(yù)后的影響因素，繪制NCAM1、TTR 預(yù)測TBM 患者預(yù)后的受試者工作特征（ROC）曲線，采用DeLong 檢驗比較ROC 曲線下面積。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組和TBM 組基線血清NCAM1、TTR 水平比較 TBM 組基線血清NCAM1、TTR 水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 對照組和TBM 組基線血清NCAM1、TTR 水平比較（±s，mg/L）Table 1 Comparison of baseline serum NCAM1 and TTR levels between healthy physical examinees and tuberculous meningitis patients

表1 對照組和TBM 組基線血清NCAM1、TTR 水平比較（±s，mg/L）Table 1 Comparison of baseline serum NCAM1 and TTR levels between healthy physical examinees and tuberculous meningitis patients

注：TBM=結(jié)核性腦膜炎，NCAM1=神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1，TTR=轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白

2.2 不同病情程度TBM 患者基線血清NCAM1、TTR水平比較 Ⅲ期TBM 患者血清NCAM1、TTR 水平低于Ⅱ期和Ⅰ期TBM 患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Ⅱ期TBM 患者血清NCAM1、TTR 水平低于Ⅰ期TBM患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 不同病情程度TBM 患者基線血清NCAM1、TTR 水平比較（±s，mg/L）Table 2 Comparison of baseline serum NCAM1 and TTR levels in tuberculous meningitis patients by the stage distinguished by British Medical Research Council staging system

表2 不同病情程度TBM 患者基線血清NCAM1、TTR 水平比較（±s，mg/L）Table 2 Comparison of baseline serum NCAM1 and TTR levels in tuberculous meningitis patients by the stage distinguished by British Medical Research Council staging system

注：a 表示與Ⅰ期比較P<0.05，b 表示與Ⅱ期比較P<0.05

2.3 不同預(yù)后TBM 患者血清NCAM1、TTR 水平變化 組間與時間對不同預(yù)后TBM 患者血清NCAM1、TTR水平存在交互作用（P<0.05），組間及時間分別對血清NCAM1、TTR 水平主效應(yīng)顯著（P<0.05），其中預(yù)后不良TBM 患者基線、入院7 d、入院14 d、隨訪1 個月、隨訪6 個月、隨訪12 個月血清NCAM1、TTR 水平均低于預(yù)后良好TBM 患者（P<0.05），見表3。

表3 不同預(yù)后TBM 患者血清NCAM1、TTR 水平差異（±s，mg/L）Table 3 Differences of serum NCAM1 and TTR levels in tuberculous meningitis patients with good and poor prognosis

表3 不同預(yù)后TBM 患者血清NCAM1、TTR 水平差異（±s，mg/L）Table 3 Differences of serum NCAM1 and TTR levels in tuberculous meningitis patients with good and poor prognosis

注：a 表示與預(yù)后良好比較P<0.05

2.4 影響TBM 患者預(yù)后的因素分析 預(yù)后不良TBM 患者的年齡、意識改變、認(rèn)知功能障礙、顱神經(jīng)麻痹、腦積水比例、住院時間、腦脊液有核細(xì)胞數(shù)、腦脊液有核細(xì)胞/單核細(xì)胞比值高于預(yù)后良好TBM 患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；兩組MRC 分級比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表4。將上述有統(tǒng)計學(xué)差異的指標(biāo)納入多因素Logistic 回歸分析，以ENTER 法篩選變量，結(jié)果顯示MRC 分期為Ⅲ期是TBM 患者預(yù)后不良的危險因素（P<0.05），基線高水平NCAM1、TTR 是TBM 患者預(yù)后不良的保護因素（P<0.05），見表5。

表4 TBM 患者預(yù)后影響因素的單因素分析Table 4 Univariate analysis of associated factors for prognosis in tuberculous meningitis patients

表5 TBM 患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic 回歸分析Table 5 Multivariate Logistic regression analysis of prognostic factors in tuberculous meningitis patients

2.5 基線NCAM1、TTR 預(yù)測TBM 患者預(yù)后的價值分析 基線NCAM1、TTR 預(yù)測TBM 患者預(yù)后不良的截斷值為210.15 mg/L、125.36 mg/L，ROC 曲線下面積為0.665、0.689，聯(lián)合（基線NCAM1+基線TTR）（結(jié)合多因素Logistic 回歸分析計算聯(lián)合預(yù)測值）預(yù)測TBM 患者預(yù)后的ROC 曲線下面積為0.879，高于單獨基線NCAM1、TTR 的ROC 曲線下面積（Z=4.428、3.941，P<0.001），見圖1 和表6。

圖1 基線NCAM1、TTR 預(yù)測TBM 患者預(yù)后的ROC 曲線Figure 1 ROC curve of baseline NCAM1 and TTR，either alone or in combination，in predicting prognosis of tuberculous meningitis patients

表6 基線NCAM1、TTR 預(yù)測TBM 患者預(yù)后的效能Table 6 Efficacy of baseline NCAM1 and TTR，either alone or in combination，in predicting prognosis of tuberculous meningitis patients

3 討論

TBM 是一種高死亡率和高致殘率的神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，盡管接受了足夠療程的抗結(jié)核治療，但成年TBM患者預(yù)后依然很差［9］。結(jié)核分枝桿菌通過淋巴系統(tǒng)或血液運輸至全身，并跨越血-腦脊液屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，直接感染小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，導(dǎo)致白介素6、腫瘤壞死因子α 等多種致炎細(xì)胞因子分泌和活性氧生成，介導(dǎo)炎性反應(yīng)，進一步增加血-腦脊液屏障通透性，引起腦脊液白細(xì)胞增多、蛋白質(zhì)積累和腦膜炎癥，且細(xì)菌負(fù)荷持續(xù)存在與腦膜炎病理程度加重密切相關(guān)［10］。目前TBM 的診斷主要結(jié)合臨床癥狀、腦脊液實驗室檢查和顱腦影像學(xué)檢查等，腦脊液病原學(xué)診斷是TBM 實驗診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)時間長（42 d）、培養(yǎng)成本高，容易導(dǎo)致病情延誤，TBM 的治療目前仍是基于肺結(jié)核治療方案，由于血-腦脊液屏障滲透性差，可能導(dǎo)致腦脊液中的藥物濃度不理想，治療效果不佳［11］。因此迫切需要探討與TBM 密切相關(guān)的生物標(biāo)志物。

NCAM1 是一種多功能跨膜蛋白，位于人類11 號染色體（11q23.1），主要在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的識別和黏附，參與突觸可塑性、中樞神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生，NCAM1 功能障礙會損害突觸形成、突觸活動和可塑性［12-13］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)NCAM1 異常表達與雙相情感障礙、精神分裂癥有關(guān)［12］，自閉癥譜系障礙患兒血漿 NCAM1 水平明顯降低，且NCAM1 水平與社會動機、社會交流和社會反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)［13］。NCAM1還可通過與S100A9 淀粉樣蛋白相互作用，以濃度依賴性方式促進 S100A9 淀粉樣蛋白觸發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)和神經(jīng)炎性反應(yīng)，參與神經(jīng)退行性疾?。?4］，與空間記憶受損和認(rèn)知功能障礙有關(guān)［15］。NCAM1 與TBM 的報道十分少見，本研究發(fā)現(xiàn)TBM 患者基線血清NCAM1 水平明顯降低，且隨著TBM 病情加重而降低，預(yù)后不良患者血清NCAM1 水平在基線、入院7 d、入院14 d、隨訪1 個月、隨訪6 個月、隨訪12 個月時均低于預(yù)后良好患者，多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示NCAM1 與TBM 預(yù)后不良有關(guān)，表明NCAM1 缺失可能與TBM 發(fā)病和病情進展有關(guān)，分析原因可能為：結(jié)核分枝桿菌顱內(nèi)感染引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致NCAM1 合成減少，NCAM1 缺失可進一步影響受損神經(jīng)組織修復(fù)和新生神經(jīng)發(fā)生，加重病情進展。ROC 曲線分析結(jié)果顯示NCAM1 預(yù)測TBM 患者預(yù)后不良的ROC 曲線下面積為0.665，可以看出NCAM1預(yù)測TBM 患者預(yù)后不良具有較高的效能，提示NCAM1有望作為TBM 預(yù)后預(yù)測的潛在標(biāo)志物。

TTR 是甲狀腺素和視黃醇的載體蛋白，位于人類18號染色體（18q11.2-12.1），由肝臟或脈絡(luò)叢產(chǎn)生后易位到血液或腦脊液中，以四聚體形式存在，負(fù)責(zé)運輸甲狀腺素和視黃醇［16］。TTR 作為載體蛋白通過與淀粉樣蛋白β（Amyloid beta，Aβ）寡聚體結(jié)合抑制新 Aβ 聚集體的生長和形成，降低細(xì)胞毒性。TTR 結(jié)構(gòu)突變會降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致四聚體的不穩(wěn)定性和分解，形成淀粉樣TTR 聚集體，沉積到組織和神經(jīng)元中并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性作用，引起不同淀粉樣變疾病，由此TTR 被認(rèn)為是淀粉樣變性的生物學(xué)標(biāo)志物［17］。本研究發(fā)現(xiàn)TBM 患者基線血清TTR 水平降低，且預(yù)后不良患者不論在基線還是入院7 d、入院14 d、隨訪1 個月、隨訪6 個月、隨訪12 個月時血清TTR 水平均低于預(yù)后良好患者，說明低水平TTR 與 TBM 神經(jīng)系統(tǒng)損害加重和預(yù)后不良有關(guān)。腦膜炎大鼠模型可觀察到大腦皮質(zhì)Aβ1～42 表達增高和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化，這與神經(jīng)認(rèn)知功能衰退和腦膜炎后遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥有關(guān)［18］，而TTR 可切割 Aβ形成活性較低的短肽，降解已經(jīng)聚集的Aβ 肽，TTR 正常表達下，Aβ 聚集減少并且 Aβ 的毒性被消除［19-20］，說明TTR 可通過抑制Aβ 活性和沉積，預(yù)防腦膜炎引起的淀粉樣變性，減輕神經(jīng)組織損傷，而TTR 減少后其對Aβ 活性抑制作用降低，導(dǎo)致腦膜炎后神經(jīng)元損傷和神經(jīng)預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示TTR 預(yù)測TBM 患者預(yù)后不良的ROC 曲線下面積為0.689，說明TTR 具有預(yù)測TBM 患者預(yù)后的效能，但是靈敏度和特異度均偏低，兩者聯(lián)合后預(yù)測效能明顯提高，可為TBM 預(yù)后判斷提供更可靠的信息。

本研究多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示MRC 分期Ⅲ期是TBM 患者預(yù)后不良的危險因素，說明TBM 神經(jīng)損傷越重，患者遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的可能性越大，臨床對于Ⅲ期患者應(yīng)提高警惕，優(yōu)化治療方案，以避免神經(jīng)預(yù)后不良的發(fā)生。

綜上，TBM 患者血清NCAM1、TTR 水平均降低，NCAM1、TTR 水平低下與TBM 發(fā)生和病情加重有關(guān)。NCAM1、TTR 缺乏可能通過加重神經(jīng)系統(tǒng)損傷參與TBM發(fā)病和進展過程，聯(lián)合兩項指標(biāo)診斷TBM 具有更高的效能。

本研究不足之處在于樣本例數(shù)偏少，可能導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)偏倚，該結(jié)論尚待進一步擴大樣本例數(shù)加以探討；尚未納入其他腦膜炎病例，NCAM1、TTR 是否可鑒別TBM 和其他類型腦膜炎尚不完全清楚，仍需進一步招募其他類型腦膜炎病例加以證實。

作者貢獻：吳云虹負(fù)責(zé)設(shè)計研究方案，實施研究，論文撰寫；周少瓏提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，審核論文，對論文整體負(fù)責(zé)；王景負(fù)責(zé)實施研究，資料搜集整理，論文修改；蔡奕秋進行統(tǒng)計學(xué)分析；林雅明負(fù)責(zé)課題設(shè)計，論文撰寫。

本文無利益沖突。