佩利措伊斯-梅茨巴赫病臨床及遺傳學特征分析

牛國輝，張曉莉，李林琛，劉紅星，崔 博，王 鑫，謝加陽，賈天明

(1.鄭州大學第三附屬醫(yī)院兒童康復科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbache disease，PMD)是最常見的彌漫性腦白質(zhì)髓鞘形成障礙性疾病，遺傳方式為X連鎖隱性遺傳，由編碼蛋白脂蛋白1(proteolipid protein l，PLP1)基因變異所致[1-2]；PMD臨床上主要表現(xiàn)為眼球震顫、聽力障礙、肌張力低下、共濟失調(diào)及進行性運動功能障礙[3]。PMD的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，且大部分患者存在肌張力異常，很容易造成誤診。本研究旨在通過對2015年6月至2020年10月鄭州大學第三附屬醫(yī)院臨床及基因診治的14例PMD患兒的臨床、影像學資料及基因檢測結果進行回顧性分析，探討PMD的臨床及分子遺傳學特征，以期為進一步的遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2015年6月至2020年10月在鄭州大學第三附屬醫(yī)院兒科及康復科就診的12個家系共14例PMD患兒為研究對象。納入標準：(1)存在眼球震顫、發(fā)育遲緩、肌張力減退、共濟失調(diào)、錐體外系體征、痙攣性截癱等典型臨床表現(xiàn)；(2)頭顱磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)提示腦白質(zhì)髓鞘化障礙；(3)PLP1基因檢測異常；(4)患兒監(jiān)護人知情同意并簽署知情同意書。排除標準：(1)臨床或基因檢測資料不全；(2)其他原因所致彌漫性腦白質(zhì)髓鞘形成障礙性疾病。14例PMD患兒中，10例為散發(fā)病例(病例1～10)，病例11和12系兄弟兩人，病例13和14系兄弟兩人。父母均非近親婚配，身體健康，圍生期均未見異常?；純焊黜椛锘瘜W檢查及血尿代謝篩查均未見異常。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準[(2017)醫(yī)倫審第10號]。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集收集先證者及家系受累成員的臨床表現(xiàn)、輔助檢查結果[包括頭顱MRI、發(fā)育評估情況、腦干聽覺誘發(fā)電位(auditory brainstem response，ABR)]等，0～6歲患兒發(fā)育評估采用Gesell發(fā)育量表[4]中的適應能力及大運動能區(qū)的發(fā)育商(development quotient，DQ)評估，>6歲患兒采用韋氏兒童智力量表[5]的總智商評估。

1.2.2 基因突變檢測采集14例患兒的外周靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸抗凝，利用磁珠法自動核酸提取儀提取血液樣本中基因組DNA，應用分光光度計測量DNA的濃度及純度。因PLPl基因變異以重復突變?yōu)橹?，首先應用多重連接探針擴增(multiple ligation probe amplification，MLPA)方法對患兒進行PLPl基因變異檢測，使用MRC-Holland MLPA試劑盒進行多重探針連接探針，采用基因分析儀ABI3730xL進行片段分析檢測，試劑盒購自荷蘭MRC Holland生物公司，嚴格按照試劑盒說明進行操作。若MLPA檢測未發(fā)現(xiàn)異常，進一步通過靶向捕獲二代測序法進行基因檢測；根據(jù)靶向捕獲測序結果，對患兒及其父母DNA進行Sanger測序驗證。

2 結果

2.1 PMD患兒的臨床特征分析結果結果見圖1和表1。14例患兒均為男性，就診年齡5 d至10歲，起病年齡1 d至7個月。首發(fā)癥狀：眼球震顫9例(64.2%)，大運動發(fā)育遲緩3例(21.4%)，呻吟樣呼吸、哭聲弱1例(7.1%)，異常姿勢2例(14.3%)。臨床表現(xiàn)：14例患兒存在發(fā)育遲緩，其中10例以運動發(fā)育遲緩更為明顯，3例(病例7、10、13)運動、智力發(fā)育遲緩程度接近。8例>1歲的患兒中1例能夠獨立行走，其余7例無獨立行走能力；12例存在眼球震顫，2例無眼球震顫。肌張力低下10例，肌張力增高3例，肌張力正常1例。臨床分型：經(jīng)典型8例，先天型2例，中間型4例。頭顱MRI：14例患兒頭顱MRI均表現(xiàn)為T2加權像彌漫性高信號，提示腦白質(zhì)髓鞘化障礙(圖1)。病例9因為四肢肌張力低下，膝腱反射未引出，行肌電圖檢查，提示四肢神經(jīng)源性損害，其余病例未做肌電圖檢查。14例患兒均行ABR檢測，其中7例異常。

A：第三腦室上部層面；B：側腦室體部層面；箭頭示腦白質(zhì)高信號。

表1 14例PMD患兒的臨床特征

2.2 14例PMD患兒PLP1基因突變檢測結果結果見表2。12例先證者中，通過MLPA檢測發(fā)現(xiàn)7例(病例1、2、3、4、5、6、7)為2～8號外顯子重復變異。全外顯子檢測發(fā)現(xiàn)1例(病例8)為X染色體Xq22.2處重復0.33 Mb區(qū)域，覆蓋了 PMD 100.00%的區(qū)域；1例(病例9)為c.83G>A變異，1例(病例10)為c.226G>C變異，2例(病例11、12)為c.259delC變異，2例(病例13、14)為c.157dupA變異。家系驗證分析顯示，12例先證者的基因變異均來自無臨床表型的母親。

表2 14例PMD患兒PLP1基因突變的基因型特點

3 討論

PMD為最常見的髓鞘化障礙所導致的腦白質(zhì)疾病，其發(fā)病率為(1.45～1.90)/10萬活產(chǎn)男嬰，但也有女性發(fā)病的報道，推測可能的機制是由于X染色體的非隨機失活[6]。PMD是單基因遺傳病，近年來進行了動物模型研究及相關治療的研究[7-8]。應用神經(jīng)干細胞和神經(jīng)膠質(zhì)祖細胞移植進行治療可取得一定療效[9-10]；鐵螯合物可降低PMD少突膠質(zhì)細胞的死亡率[11]；生酮飲食可恢復少突膠質(zhì)細胞的完整性并增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成[12-13]。但上述治療方法均未得到循證醫(yī)學的支持。還有一些化學方法篩選的增強子和抑制基因表達的治療尚處于動物實驗階段[14-16]，炎癥與PMD病理生理學的關系到目前為止仍沒有定論[17]。故對PMD來說目前尚無有效的病因治療方法，主要采取針對受累功能的康復治療，以延緩各種功能的倒退，提高生活質(zhì)量[18]。因此，盡早篩查出攜帶者，進行產(chǎn)前診斷尤為重要。

PMD按起病年齡及病情的嚴重程度分為3型：先天型、中間型和經(jīng)典型，其中經(jīng)典型最為多見。先天型PMD患兒病情最為嚴重，出生時或生后數(shù)周內(nèi)即出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)為鐘擺樣眼球震顫、喉鳴、吞咽困難、肌張力低下等，多于嬰兒或兒童期死亡，少數(shù)存活至30歲以后。經(jīng)典型PMD患兒常于出生后數(shù)月發(fā)現(xiàn)眼球震顫、肌張力低下及運動發(fā)育遲緩，隨病程進展逐漸出現(xiàn)肢體痙攣，可存活至30～70歲。中間型PMD臨床表現(xiàn)介于先天型與經(jīng)典型之間[2]。在本研究中8例患兒(病例1～8)表現(xiàn)為經(jīng)典型；2例(病例9、10)表現(xiàn)為先天型，2個家系兄弟共4人(病例11、12和病例13、14)表現(xiàn)為中間型。首發(fā)癥狀以眼球震顫最為常見(64.2%)，其次為大運動發(fā)育遲緩(21.4%)。在整個病程中發(fā)育遲緩(100%)、肌張力異常(92.9%)、眼球震顫(85.7%)是最常見的癥狀，與相關報道一致[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，先天型PMD患兒的智力和運動能力均明顯落后，二者落后的程度相近，而經(jīng)典型和中間型PMD患兒的運動能力落后更為明顯。病例9的四肢肌電圖呈神經(jīng)源性損害，說明點突變致先天型PMD患兒可導致外周神經(jīng)損傷PMD。14例PMD患兒中ABR異常者7例，說明聽覺傳導通路也容易受到損傷。而ABR異常者均為就診時年齡較小的患兒(<1歲)，推測聽通路早期的損傷隨著年齡的增長有逐漸恢復的可能。頭顱MRI對PMD的診斷意義重大，其表現(xiàn)為髓鞘形成明顯落后于同齡兒，且并無腦白質(zhì)破壞[20]。本研究中14例患兒均提示腦白質(zhì)髓鞘化過程障礙，符合PMD的特征性頭顱MRI表現(xiàn)。因此，在臨床工作中對早期出現(xiàn)眼球震顫、運動發(fā)育落后且無明顯高危因素的患兒應考慮到本病可能，應進一步檢查頭顱MRI以了解腦白質(zhì)的發(fā)育情況。

PLP1為PMD的致病基因，在哺乳動物中高度保守，長約17 kb，定位于Xq22.1，含有7個外顯子和6個內(nèi)含子，編碼PLP1蛋白和DM20蛋白，PLP1蛋白由276個氨基酸組成，DM20是其剪切異構體，比其短35個氨基酸。PLP1蛋白主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的髓鞘中表達，是髓鞘的主要成分。PLP1基因存在多種變異類型，目前已發(fā)現(xiàn)與PMD 相關的 PLP1基因突變約有335種，包括重復變異、點突變、缺失變異，近年來發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子缺失也可致病[21]，其中最為常見的是重復變異[22]，重復變異占PLP1基因突變的50%～70%。本研究首先采用MLPA方法對PLP1基因進行變異檢測，未發(fā)現(xiàn)異常后再進行二代測序，并通過一代測序法進行位點驗證及家系驗證；結果發(fā)現(xiàn)，7例為2～8號外顯子重復變異，1例為X染色體Xq22.2處重復0.33 Mb區(qū)域(覆蓋了 PMD 100.00%的區(qū)域)，1例為c.83G>A變異，1例為c.226G>C變異，2例為c.259delC變異，2例為c.157dupA變異；提示PMD以重復變異[8例(占57%)]為主，與其他研究結果接近[19]。c.83G>A為錯義變異，導致氨基酸由甘氨酸變?yōu)楸彼幔瑢ζ溥M行保守性預測結果顯示，該位點進化上保守，具有潛在的功能影響；對其進行蛋白功能預測結果顯示為有害。該變異未見相關文獻報道及收錄，但有報道該位點的其他形式變異(c.83G>T:p.G28V)與PMD相關[23]。c.226G>C變異可導致第226位的纈氨酸被亮氨酸取代，對基因或基因產(chǎn)物功能可造成有害影響，已有文獻報道[24]。c.259delC變異導致從第87號氨基酸Leu開始的氨基酸合成發(fā)生改變，并在改變后的第27個氨基酸終止(p.Leu87TrpfsTer27)，為移碼變異，可導致蛋白質(zhì)功能受到影響，為有可能致病的基因變異。c.157dupA變異導致從第54號氨基酸Asn開始的氨基酸合成發(fā)生改變，在改變后的第6個氨基酸終止(p.Asn54Lysfs*6)，為移碼變異，可導致蛋白截短；在人類外顯子數(shù)據(jù)庫、參考人群千人基因組和人群基因組突變頻率數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)該變異；最終判讀為可能致病。與重復變異相比，缺失變異非常罕見，且其突變原因尚不清楚，涉及多個鄰近基因的較大缺失會導致胚胎死亡，部分小的缺失患兒才能存活。PMD的臨床表型與基因型存在一定的相關性。許多患者的臨床表現(xiàn)介于先天型和經(jīng)典型之間或經(jīng)典型和痙攣性截癱之間。PLP1基因重復變異多表現(xiàn)為經(jīng)典型或中間型；點突變患者可表現(xiàn)為從先天型到痙攣性截癱的所有PMD的疾病類型，但先天型PMD患兒全部是由點突變所致；缺失變異患兒一般臨床癥狀較輕，可僅表現(xiàn)為痙攣型截癱或無PLP1綜合征[2]。在本研究中重復突變患者(病例1～8)均表現(xiàn)為經(jīng)典型；而6例點突變患者中有2例表現(xiàn)為先天型(病例9、10)，推測突變位點位于PLP1基因的保守區(qū)域，而2個家系兄弟共4人(病例11、12和病例13、14)表現(xiàn)為中間型，突變位點可能位于PLP1基因的非保守區(qū)域。

綜上所述，本研究顯示PMD患兒的首發(fā)癥狀以眼球震顫最為常見；發(fā)育遲緩、肌張力異常、眼球震顫是最常見的臨床癥狀；頭顱MRI提示腦白質(zhì)髓鞘化障礙。PLP1基因突變中重復變異最多，其次為點突變，c.83G>A、c.226G>C、c.259delC、c.157dupA變異為尚未報道的新突變，這一發(fā)現(xiàn)拓寬了PMD致病基因的變異譜，加深了對PMD的基因型及表型的認識，對其早期診斷并指導遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷有重要臨床意義。但本研究樣本量偏少且沒有進行隨訪，需要在今后的研究中不斷增加樣本量并進行長期隨訪。