MPFC－QuEChERS結(jié)合GC－MS/MS測(cè)定血液中γ-羥基丁酸

李潤康，李佳宜，張?jiān)品?，董林沛，何洪源，魏春?/p>

（1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.中國人民公安大學(xué) 偵查學(xué)院，北京 100038）

γ-羥基丁酸（GHB）是一種存在于多種哺乳動(dòng)物組織中的內(nèi)源性短鏈脂肪酸，對(duì)多巴胺能和γ-氨基丁酸（GABA）能系統(tǒng)具有特殊的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用［1］。羥丁酸鈉（GHB的鈉鹽）可用于治療由1型發(fā)作性睡病引起的日間睡眠亢進(jìn)、猝倒、睡眠癱瘓、幻覺和夜間睡眠嚴(yán)重紊亂等癥狀［2］。在一些歐洲國家，羥丁酸鈉也用于酒精戒斷綜合癥的治療和酗酒者的戒酒維持［3－4］。但近年來，我國娛樂場(chǎng)所中出現(xiàn)以GHB作為濫用藥物對(duì)女性受害者實(shí)施性侵犯案件［5］，各類毒駕、死亡等案件也常涉及GHB［6－8］。GHB在體內(nèi)的代謝非常迅速，血中的檢測(cè)窗口為6 h，但至今仍未發(fā)現(xiàn)一種可靠的代謝物可作為人體攝入GHB的生物標(biāo)志物［9］。因此，通過測(cè)定血液中GHB的含量判別供體是否攝入GHB仍然十分必要，但血液成分復(fù)雜，存在個(gè)體差異，且具有內(nèi)源濃度干擾而難以獲得空白樣品，使得常規(guī)的方法驗(yàn)證和高效批量的定量測(cè)定難以實(shí)現(xiàn)。

目前，血液中GHB的檢測(cè)方法主要有液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS/MS）［10－11］、氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS）［12］和氣相色譜－三重四極桿質(zhì)譜法（GC－MS/MS）［13］等，定量分析大多采用忽略血液中GHB內(nèi)源濃度的策略，這在一定程度上對(duì)定量結(jié)果造成了較大誤差。同時(shí)，許多方法在前處理過程中未進(jìn)行樣品凈化，使得進(jìn)樣液中可能存在大量的干擾物質(zhì)，導(dǎo)致方法基質(zhì)效應(yīng)高、靈敏度低或穩(wěn)定性差［14］。在眾多方法中，LC－MS/MS和GC－MS法的靈敏度較低，檢出限僅達(dá)到0.1 mg/L或更高，而GC－MS/MS法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)低濃度的血液樣品時(shí)，可有效防止假陰性結(jié)果［15］。

針對(duì)上述問題，本研究旨在建立一種基于快速多濾過型凈化柱（MPFC）－QuEChERS凈化和GCMS/MS的檢測(cè)血液中GHB的分析方法。針對(duì)血液樣品中存在內(nèi)源性GHB而導(dǎo)致的定量不準(zhǔn)確問題，通過優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件與儀器條件，采用MPFC－QuEChERS柱凈化提取液，能夠減少基質(zhì)中雜質(zhì)對(duì)分析儀器的損害，同時(shí)大大降低基質(zhì)效應(yīng)，提高方法的準(zhǔn)確度和靈敏度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GCMS－TQ8050 NX氣相色譜－三重四極桿質(zhì)譜儀（日本Shimadzu公司）；DB－5ms色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm，美國Agilent公司）；CUTE MIXER CM－1000型高速振蕩器（日本Tokyo Rikakaka公司）；Thermo－Fisher Biofuge Primo R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）；電子溫控烘箱（上海美墨爾特貿(mào)易有限公司）；W880旋蒸濃縮儀（北京吉艾姆科技有限公司）。

1.0 mg/mL的GHB鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)標(biāo)物GHB－D6鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品（美國Cerilliant公司），分別用甲醇稀釋后得到50、100、250、500、750、1 000 ng/mL的GHB標(biāo)準(zhǔn)溶液與1μg/mL的GHB－D6標(biāo)準(zhǔn)溶液。

衍生化試劑：N，O-雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺（BSTFA，99%）+三甲基硅烷（TMCS，1%）（上海羅恩試劑公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、環(huán)己烷、二氯甲烷（美國Fisher Scientific公司，色譜純）；叔丁基甲醚、氯化銨、鹽酸（分析純，美國Fisher Scientific公司）；QuSEL多功能針式過濾器（MF－3301，天津阿爾塔科技有限公司）；m－PFC快速濾過型（高脂類）凈化柱、MPFC－QuEChERS凈化柱（北京綠綿科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。血液樣品均取自未使用過GHB的健康人。

1.2 儀器條件

色譜條件：Agilent DB－5ms色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；升溫程序：初始溫度60℃，保持2 min，以10℃/min升至260℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度為260℃；載氣為高純氦氣（99.999%），柱流量：1.56 mL/min；不分流進(jìn)樣模式，進(jìn)樣量：1μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離源（EI源），離子源溫度為230℃，接口溫度為320℃，溶劑延遲時(shí)間為2 min，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，掃描間隔0.15 s，碰撞氣為高純氬氣（99.999%）。

1.3 樣品前處理

取0.1 mL全血樣品置于15 mL塑料離心管中，加入10μL 1μg/mL的GHB－D6標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入0.5 mL pH 1～2的氯化銨飽和溶液，渦旋混勻后加入3 mL乙酸乙酯，將離心管密封，振蕩10 min，以8 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至MPFC－QuEChERS凈化柱中。使用推桿緩慢下壓凈化柱頂部，用尖底玻璃管收集濾液，揮干，加入150μL乙酸乙酯復(fù)溶并轉(zhuǎn)移至裝有內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中，加入10μL衍生化試劑BSTFA密封，將進(jìn)樣瓶放入烘箱80℃反應(yīng)20 min，冷卻后供GC－MS/MS分析。

1.4 內(nèi)源濃度校正

本文借助Desharnais等［16］開發(fā)的內(nèi)源濃度自動(dòng)校正工具，對(duì)血液樣品中內(nèi)源性的GHB濃度進(jìn)行校正。

1.4.1工作溶液的配制與測(cè)定采用同一份血液樣品配制加標(biāo)濃度為0、50、100、250、500、750、1 000 ng/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（含100 ng/mL的GHB－D6），在最優(yōu)前處理和儀器條件下測(cè)得系列濃度所對(duì)應(yīng)的分析物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值。

1.4.2內(nèi)源濃度自動(dòng)校正工具的使用將上述系列加標(biāo)濃度與所對(duì)應(yīng)的分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值數(shù)據(jù)輸入內(nèi)源濃度自動(dòng)校正工具，計(jì)算得到工作溶液中分析物的實(shí)際濃度，采用實(shí)際濃度對(duì)GHB與GHB－D6的峰面積比值進(jìn)行線性擬合，得到近似經(jīng)過零點(diǎn)的工作曲線從而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源濃度校正。內(nèi)源濃度自動(dòng)校正工具通過開源統(tǒng)計(jì)軟件RStudio（圖形界面，https：//www.rstudio.com/）和R（編程環(huán)境，https：//www.r－project.org/）編寫和運(yùn)行，原版腳本和使用說明參見文獻(xiàn)［16］。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將質(zhì)量濃度為100 ng/mL的GHB與GHB－D6混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按本方法前處理后，在GC-MS/MS的全掃描采集模式下進(jìn)行檢測(cè)，獲得GHB衍生物（GHB－2TMS）與GHB－D6衍 生 物（GHB－D6－2TMS）的離子碎片和保留時(shí)間，選擇豐度高且質(zhì)荷比大的特征離子作為母離子。在5～45 eV的碰撞能量（CE）范圍內(nèi)對(duì)母離子進(jìn)行碰撞解離，選擇合適的產(chǎn)物離子作為子離子，組成監(jiān)測(cè)離子對(duì)，得到各離子的豐度比并確定最優(yōu)碰撞能量，最終優(yōu)化的MRM參數(shù)見表1。在優(yōu)化條件下，測(cè)得加標(biāo)100 ng/mL GHB與GHB－D6的血液樣品的MRM色譜圖見圖1。

表1 GHB與GHB－D6衍生物的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of GHB and GHB－D6 derivative

圖1 GHB與GHB－D6衍生物的MRM色譜圖Fig.1 MRMchromatograms of GHB and GHB－D6 derivative

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的優(yōu)化考察了環(huán)己烷、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚等常見有機(jī)溶劑對(duì)GHB的提取效率。結(jié)果表明，乙酸乙酯對(duì)GHB的提取效率最高（圖2A）。由于乙酸乙酯較易揮發(fā)，所需揮干時(shí)間短，對(duì)操作人員健康損害較小，實(shí)驗(yàn)選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.2.2樣品溶液pH值的優(yōu)化GHB的羧酸基團(tuán)在樣品溶液中會(huì)發(fā)生電離，而酸性環(huán)境能有效抑制其電離，同時(shí)鹽析作用也可促進(jìn)GHB向有機(jī)層轉(zhuǎn)移，因此考察了氯化銨飽和溶液的pH值分別為1～2、2～3、3～4、4～5、5～6、6～7時(shí)GHB的提取效率。結(jié)果表明，pH值越小，GHB的提取效率越高，pH值為1～2時(shí)的提取效率明顯高于其他pH值（圖2B）。因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH 1～2的氯化銨飽和溶液為緩沖液。

2.2.3衍生化試劑用量的優(yōu)化衍生化試劑不但會(huì)損害色譜柱，而且會(huì)增加雜質(zhì)干擾，大大降低檢測(cè)靈敏度。因此，考察了衍生化試劑BSTFA用量（1、5、10、15、20、25μL）對(duì)GHB提取效率的影響。結(jié)果表明，衍生化試劑用量為1μL時(shí)不足以衍生化完全；用量為5μL時(shí)GHB的峰面積有較大提高，接近峰值；用量為10μL時(shí)GHB的峰面積最大（圖2C）?？芍?μL的衍生化試劑可將大部分GHB衍生化。為保證所用的衍生化試劑過量，同時(shí)減少其用量，實(shí)驗(yàn)選擇衍生化試劑用量為10μL。

圖2 不同前處理?xiàng)l件對(duì)GHB提取效率的影響Fig.2 Effect of different preparation conditions on extraction efficiency of GHB

2.2.4衍生化時(shí)間的優(yōu)化考察了衍生化時(shí)間（5、10、15、20、25 min）對(duì)GHB提取效率的影響。結(jié)果表明，提取效率隨著衍生化時(shí)間的增加而增大，衍生化時(shí)間為20 min和25 min時(shí)的提取效率相差不明顯（圖2D）。為節(jié)省前處理時(shí)間，實(shí)驗(yàn)選擇衍生化時(shí)間為20 min。

2.2.5凈化柱的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用pH 1～2的氯化銨飽和溶液，使得樣品溶液的酸性大大增強(qiáng)，導(dǎo)致全血中存在的大量血細(xì)胞、蛋白質(zhì)、色素和脂質(zhì)等會(huì)發(fā)生破裂、變性、解離并釋放出許多小分子雜質(zhì)。這些雜質(zhì)易被有機(jī)溶劑提取并殘留在樣品提取物中，使最終進(jìn)樣液呈渾濁狀態(tài)，從而導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)和儀器檢測(cè)靈敏度下降，并且需要頻繁地進(jìn)行清潔電離源、更換襯墊等儀器維護(hù)。通過使用凈化柱可有效去除提取液中的雜質(zhì)，降低基質(zhì)干擾，但不同凈化柱的凈化和提取效果不同。

乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）能吸附有機(jī)酸、脂肪酸、糖類等，C18主要吸附油脂類物質(zhì)，MgSO4主要用于除水，多壁碳納米管（MWCNTs）可有效去除水溶性和脂溶性雜質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用的特定除脂材料能夠選擇性吸附基質(zhì)中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)。考察了QuSEL多功能針式過濾器（MF－3301）、m－PFC快速濾過型（高脂類）凈化柱、MPFC-QuEChERS凈化柱3種市售凈化柱的效果，凈化材料和用量見表2。提取液經(jīng)3種凈化柱凈化后及未凈化的提取效率見圖2E。結(jié)果顯示，QuSEL多功能針式過濾器和m-PFC快速濾過型凈化柱中均填充了50 mg的PSA，可有效去除提取液中的雜質(zhì)，但也大量吸附GHB，使提取效率下降。MPFC－QuEChERS凈化柱可有效去除雜質(zhì)，且對(duì)GHB的提取效率影響不大，因此實(shí)驗(yàn)選擇MPFC－QuEChERS凈化柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化。

表2 3種凈化柱的凈化材料及用量Table 2 Purification materials and dosage of three purification columns

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1線性關(guān)系與檢出限為減少血液中內(nèi)源性GHB的影響，實(shí)驗(yàn)篩選GHB內(nèi)源濃度最小的血液樣品用于方法驗(yàn)證。采用所選樣品分別配制加標(biāo)濃度為0、50、100、250、500、750、1 000 ng/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（含100 ng/mL的GHB－D6），按上述優(yōu)化的儀器條件進(jìn)行檢測(cè)（n=5），以GHB的加標(biāo)濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)，GHB與內(nèi)標(biāo)的峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)繪制工作曲線（不過零點(diǎn)）。結(jié)果顯示，GHB在0～1 000 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=0.013 9X+6.293 1，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.995 1。由于難以找出真實(shí)的空白血液樣品，故通過逐級(jí)稀釋零樣品（加標(biāo)濃度為0）評(píng)估方法的檢出限。根據(jù)所得零樣品的響應(yīng)比值算得血液樣品中GHB的內(nèi)源濃度（xe）為435.8 ng/mL，而稀釋1 000倍后仍能測(cè)得較大響應(yīng)值，考慮到稀釋倍數(shù)越大，則血液環(huán)境越接近純水，這將導(dǎo)致提取回收率增加，據(jù)此估算方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）分別為0.2、0.5 ng/mL，均遠(yuǎn)低于血液樣品中GHB的內(nèi)源性濃度。

2.3.2回收率與基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估方法的基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率時(shí)，基質(zhì)加標(biāo)和血液加標(biāo)樣品所測(cè)得的峰面積須減去零樣品的峰面積（內(nèi)源背景濃度的峰面積）［17］。采用上述選定的血液樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，配制加標(biāo)濃度水平分別為50、250、750 ng/mL的質(zhì)控樣品及相同濃度水平的GHB標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下按照本方法進(jìn)行分析（n=3），并按下式分別計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（ME）和提取回收率（R）：ME=（B－D）/A×100%，R=（C－D）/（B－D）×100%。

其中，A表示標(biāo)準(zhǔn)溶液中測(cè)得目標(biāo)物的峰面積，B表示血液樣品在前處理后加入標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的峰面積，C表示血液樣品在前處理前加入標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的峰面積，D表示零樣品在前處理后測(cè)得的峰面積。結(jié)果顯示，GHB的回收率為80.1%～84.7%，基質(zhì)效應(yīng)為87.4%～94.4%（見表3）。表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性，凈化步驟大大降低了樣品中的基質(zhì)干擾。

2.3.3相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差采用本方法對(duì)上述質(zhì)控樣品分別重復(fù)測(cè)定6次，連續(xù)測(cè)定3 d，以所得日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）評(píng)價(jià)方法的日內(nèi)和日間精密度。由表3可知，方法的日內(nèi)、日間RSD均小于15%，表明方法具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

表3 GHB的基質(zhì)效應(yīng)、回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Matrix effect，recovery and relative standard deviation of GHB

2.4 內(nèi)源濃度校正與定量

基質(zhì)中不存在內(nèi)源性分析物時(shí)，其工作曲線（在實(shí)驗(yàn)誤差限度范圍內(nèi)）應(yīng)大致經(jīng)過原點(diǎn)，而當(dāng)基質(zhì)中存在內(nèi)源性分析物時(shí)，工作曲線將整體向上平移。曲線平移是由分析物的內(nèi)源濃度在整個(gè)校準(zhǔn)濃度范圍內(nèi)產(chǎn)生的恒定響應(yīng)所致，儀器檢測(cè)到的分析物響應(yīng)實(shí)際上是內(nèi)源濃度響應(yīng)與加標(biāo)濃度響應(yīng)之和。因此，內(nèi)源性分析物工作曲線的y截距（b0）將會(huì)大于0。本實(shí)驗(yàn)借助內(nèi)源濃度自動(dòng)校正工具準(zhǔn)確計(jì)算出血液樣品中GHB的內(nèi)源濃度（xe）為435.8 ng/mL，并獲得加標(biāo)樣品中的實(shí)際濃度（校正濃度，xc）。用校正濃度替代加標(biāo)濃度繪制工作曲線，使原工作曲線發(fā)生平移，從而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源濃度校正并得到校正線性方程y=0.013 9x+0.226 7（r2=0.995 1）（圖3）。內(nèi)源濃度校正過程極大消除了由血液樣品中內(nèi)源性GHB引入的系統(tǒng)性偏差，利用校正工作曲線可以實(shí)現(xiàn)其他實(shí)際案例血液樣品中GHB的準(zhǔn)確定量。

圖3 校正前（虛線）和校正后（實(shí)線）GHB的工作曲線Fig.3 Calibration curves of GHB before correction（dashed line）and after correction（solid line）

3 結(jié) 論

本研究建立了MPFC－QuEChERS結(jié)合GC－MS/MS測(cè)定血液中GHB的方法。該方法具有成本低廉、綠色環(huán)保、選擇性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，MPFCQuEChERS凈化柱使整體方法對(duì)分析儀器的損耗大大降低，在大樣本檢測(cè)時(shí)，降低了清潔離子源、更換色譜柱和襯管等儀器維護(hù)次數(shù)，提高了批量樣品檢測(cè)的穩(wěn)定性和精密度。實(shí)驗(yàn)所采用的血液樣品中存在內(nèi)源性GHB，表明方法可用于實(shí)際案件血液樣本中GHB的檢測(cè)。對(duì)于血液樣品中存在內(nèi)源GHB的問題，通過引入內(nèi)源濃度自動(dòng)校正工具，利用校正的工作曲線可以準(zhǔn)確定量分析物，不受內(nèi)源含量的干擾并能獲得更加可靠的定量結(jié)果。內(nèi)源濃度校正過程通過R腳本自動(dòng)完成，操作過程簡(jiǎn)單高效，為實(shí)際案件檢材中GHB的準(zhǔn)確定量提供了一種新方法。